Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Термофилдер - жоғары температурада дамитын микроорганизмдер. Оларды зерттеу өмірдің экстремалды жағдайларға қалай бейімделетіні туралы құнды ақпарат бере алады. Дегенмен, әдеттегі оптикалық микроскоптармен жоғары температура жағдайларына қол жеткізу қиын. Жергілікті резистивті электр жылытуға негізделген үйде жасалған бірнеше шешімдер ұсынылды, бірақ қарапайым коммерциялық шешім жоқ. Бұл жұмыста пайдаланушының қоршаған ортасын жұмсақ сақтай отырып, термофилді зерттеулер үшін жоғары температураны қамтамасыз ету үшін микроскоптың көру өрісінде микро масштабты лазерлік қыздыру тұжырымдамасын енгіземіз. Орташа лазерлік қарқындылықта микро масштабты қыздыруға биоүйлесімді және тиімді жарық сіңіргіш ретінде алтын нанобөлшекпен қапталған субстратты қолдану арқылы қол жеткізуге болады. Микромасштабтық сұйықтық конвекциясының, жасушаның сақталуының және орталықтан тепкіш термофоретикалық қозғалыстың ықтимал әсерлері талқыланады. Әдіс екі түрде көрсетілді: (i) Geobacillus stearothermophilus, белсенді термофильді бактерия, шамамен 65°C температурада көбейеді, біз микро масштабты қыздыру кезінде өніп, өсетін және жүзетінін байқадық; (ii) Thiobacillus sp., оңтайлы гипертермофильді археа. 80°C температурада. Бұл жұмыс заманауи және қолжетімді микроскопиялық құралдарды пайдалана отырып, термофильді микроорганизмдерді қарапайым және қауіпсіз бақылауға жол ашады.
Миллиардтаған жылдар ішінде Жердегі тіршілік біздің адам тұрғысынан кейде экстремалды болып саналатын қоршаған орта жағдайларының кең ауқымына бейімделу үшін дамыды. Атап айтқанда, термофилдер деп аталатын кейбір термофильді микроорганизмдер (бактериялар, архейлер, саңырауқұлақтар) 45°С-тен 122°С1, 2, 3, 4-ке дейінгі температура диапазонында дамиды.Термофилдер әртүрлі экожүйелерде, мысалы, терең теңіз гидротермиялық саңылауларында, ыстық бұлақтарда тіршілік етеді. немесе жанартаулық аймақтар. Олардың зерттеулері соңғы бірнеше онжылдықта кем дегенде екі себепке байланысты үлкен қызығушылық тудырды. Біріншіден, біз олардан, мысалы, термофилдер 5, 6, ферменттер 7, 8 және мембраналар 9 осындай жоғары температурада қалай тұрақты болатынын немесе термофилдердің шамадан тыс сәулеленуге қалай төтеп бере алатынын біле аламыз10. Екіншіден, олар отын өндіру13,14,15,16, химиялық синтез (дигидро, спирттер, метан, амин қышқылдары және т.б.)17, биокендік18 және термотұрақты биокатализаторлар7 ,11, сияқты көптеген маңызды биотехнологиялық қолданбалардың негізі болып табылады1,11,12, 13. Атап айтқанда, қазіргі уақытта белгілі полимеразды тізбекті реакция (ПТР)19 бірінші ашылған термофилдердің бірі болып табылатын термофильді Thermus aquaticus бактериясынан бөлінген ферментті (Taq полимераза) қамтиды.
Дегенмен, термофилдерді зерттеу оңай жұмыс емес және оны кез келген биологиялық зертханада импровизациялау мүмкін емес. Атап айтқанда, тірі термофилдерді in vitro кез келген стандартты жарық микроскопымен, тіпті әдетте 40°C төмен температураға есептелген коммерциялық қол жетімді қыздыру камераларымен байқауға болмайды. 1990 жылдардан бастап жоғары температуралық микроскопия (HTM) жүйелерін енгізуге бірнеше зерттеу топтары ғана арналды. 1994 жылы Глух және т.б. Жылыту/салқындату камерасы анаэробтылықты сақтау үшін жабық тікбұрышты капиллярлардың температурасын басқаратын Peltier ұяшығын пайдалану негізінде ойластырылған 20 . Құрылғыны 2 °C/с жылдамдықпен 100 °C дейін қыздыруға болады, бұл авторларға Thermotoga maritima21 гипертермофильді бактериясының қозғалғыштығын зерттеуге мүмкіндік береді. 1999 жылы Хорн және т.б. Жасушаның бөлінуін/қосылуын зерттеу үшін коммерциялық микроскопияға жарамды қыздырылған капиллярларды қолдануға негізделген өте ұқсас құрылғы әзірленді. Ұзақ уақыт бойы салыстырмалы әрекетсіздіктен кейін тиімді HTM іздеу 2012 жылы, атап айтқанда Хорн және т.б. ойлап тапқан құрылғыны пайдаланған Вирт тобының бірқатар қағаздарына байланысты қайта басталды. Осыдан 15 жыл бұрын гипертермофилдерді қоса алғанда, көптеген архейлердің қозғалғыштығы қыздырылған капиллярлар арқылы 100°С-қа дейінгі температурада зерттелді23,24. Олар сондай-ақ жылдамырақ қыздыруға қол жеткізу үшін бастапқы микроскопты өзгертті (белгіленген температураға жету үшін 35 минуттың орнына бірнеше минут) және ортада 2 см-ден астам сызықтық температура градиентіне қол жеткізу. Бұл температура градиентін қалыптастыру құрылғысы (TGFD) биологиялық маңызды қашықтықтардағы температура градиенттеріндегі көптеген термофилдердің қозғалғыштығын зерттеу үшін пайдаланылды 24, 25 .
Жабық капиллярларды жылыту тірі термофилдерді бақылаудың жалғыз жолы емес. 2012 жылы Кувабара және т.б. Ыстыққа төзімді желіммен (Super X2; Cemedine, Жапония) тығыздалған үйде бір рет қолданылатын Pyrex камералары пайдаланылды. Үлгілер 110°C дейін қыздыруға қабілетті, бірақ бастапқыда биобейнелеуге арналмаған, коммерциялық қолжетімді мөлдір қыздырғыш пластинаға (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Жапония) орналастырылды. Авторлар 65°С температурада анаэробты термофильді бактериялардың (Thermosipho globiformans, екі еселену уақыты 24 мин) тиімді бөлінуін байқады. 2020 жылы Пулшен және т.б. Коммерциялық металл ыдыстарды (AttofluorTM, Thermofisher) тиімді қыздыру екі үйде жасалған қыздыру элементтерін қолдану арқылы көрсетілді: қақпақ және сахна (ПТР машинасынан шабыттандырылған конфигурация). Бұл байланыс біркелкі сұйықтық температурасына әкеледі және қақпақтың түбінде булану мен конденсацияны болдырмайды. О-сақинаны пайдалану қоршаған ортамен газ алмасуды болдырмайды. Сульфоскоп деп аталатын бұл HTM 75°C27 температурада Sulfolobus acidocaldarius суретін алу үшін пайдаланылды.
Барлық осы жүйелердің танылған шектеуі ауа объектілерін пайдалануды шектеу болды, кез келген майға батыру осындай жоғары температураға және >1 мм қалың мөлдір үлгілер арқылы суретке түсіруге жарамсыз. Барлық осы жүйелердің танылған шектеуі ауа объектілерін пайдалануды шектеу болды, кез келген майға батыру осындай жоғары температураға және >1 мм қалың мөлдір үлгілер арқылы суретке түсіруге жарамсыз. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температура және визуализации через прозрачные мм1 >. Барлық осы жүйелердің танылған кемшілігі ауа объектілерін пайдаланудың шектелуі болды, өйткені кез келген майға батыру мұндай жоғары температура үшін және қалыңдығы > 1 мм мөлдір үлгілер арқылы визуализация үшін жарамсыз болды.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适油浸都不适统的一个公认限制是限制使用毫米厚的透明样品成像。 Барлық осы жүйелердің танылған шектеуі ауа кіргізетін айнаны пайдалануды шектеу болып табылады, өйткені кез келген майға батыру осындай жоғары температурада қалыңдығы > 1 мм мөлдір үлгілерді кескіндеу үшін жарамсыз. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное воздушных объективов, любое иммерсионное погружение в масло непригодно для таких жоғары температура мен визуализации через прозрачные образцы мм1. Барлық осы жүйелердің белгілі кемшілігі ауа линзаларының шектеулі қолданылуы болып табылады, кез келген майға батыру мұндай жоғары температураға және қалыңдығы >1 мм мөлдір үлгілер арқылы визуализацияға жарамсыз.Жақында бұл шектеуді Чарльз-Орзаг және т.б. 28, ол бұдан былай қызықтыратын жүйенің айналасында жылуды қамтамасыз етпейтін, керісінше, ITO (индий-қалайы оксиді) резисторының жұқа мөлдір қабатымен жабылған жабын шынысының ішінде болатын құрылғыны жасады. Қақпақты мөлдір қабат арқылы электр тогын өткізу арқылы 75 °C дейін қыздыруға болады. Дегенмен, автор объективке зақым келтірмеу үшін оны объективке дейін қыздыруы керек, бірақ 65 ° C-тан аспауы керек.
Бұл жұмыстар тиімді жоғары температуралы оптикалық микроскопияны әзірлеу кеңінен қолданылмағанын, көбінесе үйде жасалған жабдықты қажет ететінін және көбінесе кеңістіктік рұқсаттың құнына қол жеткізілетінін көрсетеді, бұл термофильді микроорганизмдер бірнеше адамнан аспайтынын ескере отырып, елеулі кемшілік болып табылады. микрометрлер. Қысқартылған қыздыру көлемі HTM-ге тән үш мәселені шешудің кілті болып табылады: нашар кеңістіктік ажыратымдылық, жүйе қызған кезде жоғары термиялық инерция және экстремалды температурада қоршаған элементтердің (батыру майы, объектив линзасы… немесе пайдаланушының қолдары) зиянды қызуы. ).
Бұл жұмыста біз резистивті қыздыруға негізделмеген термофилді бақылау үшін HTM енгіземіз. Оның орнына біз жарықты сіңіретін субстратты лазермен сәулелендіру арқылы микроскоптың көру аймағының шектеулі аймағында локализацияланған жылытуға қол жеткіздік. Температураның таралуы сандық фазалық микроскопияның (QPM) көмегімен бейнеленді. Бұл әдістің тиімділігін Geobacillus stearothermophilus, шамамен 65°C температурада көбейетін және екі еселену уақыты қысқа (шамамен 20 минут) қозғалатын термофильді бактерия және Sulfolobus shibatae, 80°C температурада оңтайлы өсетін гипертермофил (archaea) көрсетеді. суреттеу. Қалыпты шағылысу жылдамдығы мен жүзу температураның функциясы ретінде байқалды. Бұл лазер HTM (LA-HTM) жабынның қалыңдығымен немесе объективтің сипатымен (ауа немесе майға батыру) шектелмейді. Бұл нарықтағы кез келген жоғары ажыратымдылықтағы линзаларды пайдалануға мүмкіндік береді. Ол сондай-ақ термиялық инерцияға байланысты баяу қыздырудан зардап шекпейді (миллисекундтық шкала бойынша лезде қыздыруға қол жеткізеді) және тек коммерциялық қол жетімді компоненттерді пайдаланады. Қауіпсіздікке қатысты жалғыз жаңа алаңдаушылықтар құрылғының ішінде және, мүмкін, қорғаныш көзілдірікті қажет ететін көз арқылы өтетін қуатты лазер сәулелерінің (әдетте 100 мВт-қа дейін) болуына байланысты.
LA-HTM принципі микроскоптың көру өрісінде үлгіні жергілікті түрде қыздыру үшін лазерді қолдану болып табылады (1а-сурет). Ол үшін үлгі жарықты жұтатын болуы керек. Ақылға қонымды лазер қуатын (100 мВт-тан аз) пайдалану үшін біз сұйық ортаның жарықты сіңіруіне сенбей, субстратты алтын нанобөлшектермен жабу арқылы үлгінің жұтылуын жасанды түрде арттырдық (сурет 1c). Алтынның нанобөлшектерін жарықпен қыздыру биомедицина, нанохимия немесе күн сәулесін жинауда күтілетін қолданбалары бар термиялық плазмоника саласы үшін түбегейлі маңызды болып табылады29,30,31. Соңғы бірнеше жылда біз осы LA-HTM-ді физика, химия және биологиядағы жылу плазмасының қолданбаларына қатысты бірнеше зерттеулерде қолдандық. Бұл әдістің негізгі қиындығы соңғы температура профилін көрсету болып табылады, өйткені жоғары температура үлгідегі микромасштаб аймағымен шектеледі. Біз температуралық картаны төрт толқын ұзындығы көлденең ығысу интерферометрімен, қарапайым, жоғары ажыратымдылықты және екі өлшемді дифракциялық торларды (айқас торлар деп те аталады) қолдануға негізделген сандық фазалық микроскопияның өте сезімтал әдісімен қол жеткізуге болатындығын көрсеттік. 33,34,35,36. Кесілген торлы толқынды микроскопияға (CGM) негізделген бұл термиялық микроскопия әдісінің сенімділігі соңғы онжылдықта жарияланған ондаған мақалада көрсетілді37,38,39,40,41,42,43.
Параллельді лазерлік қыздыру, пішіндеу және температуралық микроскопты орнату схемасы. b Алтын нанобөлшектермен қапталған қабықшасы бар AttofluorTM камерасынан тұратын үлгі геометриясы. c Үлгіні мұқият қараңыз (масштабта емес). d біркелкі лазер сәулесінің профилін және (e) алтын нанобөлшектерінің үлгі жазықтығында модельденген кейінгі температураның таралуын білдіреді. f - (g) тармағында көрсетілген нәтиже температураның таралуын модельдеуде көрсетілгендей біркелкі температураны құруға жарамды сақиналы лазер сәулесінің профилі. Масштаб жолағы: 30 мкм.
Атап айтқанда, біз жақында сүтқоректілердің жасушаларын LA-HTM және CGM көмегімен қыздыруға қол жеткіздік және 37-42 ° C диапазонында жасушалық жылу соққысының реакцияларын бақылап, бұл әдістің жалғыз тірі жасушаны бейнелеуге қолдану мүмкіндігін көрсеттік. Дегенмен, LA-HTM микроорганизмдерді жоғары температурада зерттеуге қолдану бір мәнді емес, өйткені ол сүтқоректілердің жасушаларымен салыстырғанда аса сақтықты талап етеді: біріншіден, ортаның түбін ондаған градусқа (бірнеше градусқа емес) қыздыру әкеледі. күшті тік температура градиентіне. сұйықтық конвекциясын 44 жасай алады, ол субстратқа мықтап бекітілмеген жағдайда бактериялардың жағымсыз қозғалысы мен араласуына әкелуі мүмкін. Бұл конвекцияны сұйық қабаттың қалыңдығын азайту арқылы жоюға болады. Осы мақсатта төменде келтірілген барлық тәжірибелерде металл тостағанның ішіне орналастырылған қалыңдығы шамамен 15 мкм екі жабынның арасына бактериялық суспензиялар орналастырылды (AttofluorTM, Thermofisher, 1b,c-сурет). Негізінде, егер сұйықтықтың қалыңдығы қыздыру лазерінің сәулесінің өлшемінен аз болса, конвекцияны болдырмауға болады. Екіншіден, мұндай шектеулі геометрияда жұмыс істеу аэробты организмдерді тұншықтыруы мүмкін (S2 суретті қараңыз). Бұл мәселені оттегі (немесе кез келген басқа өмірлік маңызды газ) өткізетін субстратты пайдалану арқылы, қаптаманың ішінде ауа көпіршіктерін қалдыру арқылы немесе үстіңгі қабықшада тесіктерді бұрғылау арқылы болдырмауға болады (S1 суретін қараңыз) 45 . Бұл зерттеуде біз соңғы шешімді таңдадық (сурет 1b және S1). Ақырында, лазерлік қыздыру температураның біркелкі таралуын қамтамасыз етпейді. Лазер сәулесінің бірдей интенсивтілігінде де (1д-сурет) температураның таралуы біркелкі емес, керісінше жылу диффузиясының әсерінен Гаусстың таралуына ұқсайды (1е-сурет). Мақсаты биологиялық жүйелерді зерттеу үшін көру аймағында дәл температураларды орнату болған кезде, біркелкі емес профильдер идеалды емес және олар субстратқа жабыспаса, бактериялардың термофоретикалық қозғалысына әкелуі мүмкін (S3, S4 суретті қараңыз)39. Осы мақсатта біз берілген геометриялық аймақта біркелкі температураның таралуына қол жеткізу үшін үлгі жазықтығындағы сақина пішініне (1f-сурет) сәйкес инфрақызыл лазер сәулесін кескіндеу үшін кеңістіктік жарық модуляторын (SLM) қолдандық, термиялық диффузияға қарамастан (1d-сурет) 39 , 42, 46. Қоршаған ортаның булануын болдырмас үшін металл ыдыстың үстіне үстіңгі жапқышты салыңыз (1б-сурет) және кем дегенде бірнеше күн бақылаңыз. Бұл үстіңгі қабат жабылмағандықтан, қажет болса, қосымша ортаны кез келген уақытта оңай қосуға болады.
LA-HTM қалай жұмыс істейтінін көрсету және оның термофильді зерттеулерде қолданылуын көрсету үшін біз оңтайлы өсу температурасы шамамен 60-65°C болатын Geobacillus stearothermophilus аэробты бактерияларын зерттедік. Бактерия сонымен қатар қалыпты жасушалық белсенділіктің тағы бір көрсеткішін қамтамасыз ететін флагелла мен жүзу қабілетіне ие.
Үлгілер (1b-сурет) бір сағат бойы 60°C температурада алдын ала инкубацияланды, содан кейін LA-HTM үлгі ұстағышына орналастырылды. Бұл алдын ала инкубация міндетті емес, бірақ екі себеп бойынша пайдалы: Біріншіден, лазер қосылғанда, ол жасушалардың бірден өсіп, бөлінуіне әкеледі (Қосымша материалдардағы M1 фильмін қараңыз). Алдын ала инкубациясыз, үлгідегі жаңа көру аймағын қыздырған сайын бактериялардың өсуі әдетте шамамен 40 минутқа кешіктіріледі. Екіншіден, 1 сағаттық алдын ала инкубациялау лазер қосылған кезде термофорезге байланысты жасушалардың көру өрісінен шығып кетуіне жол бермей, бактериялардың қабықшаға адгезиясына ықпал етті (Қосымша материалдардағы M2 фильмін қараңыз). Термофорез – бұл бөлшектердің немесе молекулалардың температура градиенті бойынша, әдетте ыстықтан суыққа қарай қозғалысы, ал бактериялар ерекшелік емес43,47. Бұл жағымсыз әсер лазер сәулесін пішіндеу және температураның біркелкі таралуына қол жеткізу үшін SLM пайдалану арқылы берілген аумақта жойылады.
Суретте. 2-суретте алтын нанобөлшектермен қапталған шыны субстратты сақиналы лазер сәулесімен сәулелендіру арқылы алынған CGM арқылы өлшенген температураның таралуы көрсетілген (сурет 1f). Лазер сәулесімен жабылған бүкіл аумақта температураның біркелкі таралуы байқалды. Бұл аймақ 65 ° C, оңтайлы өсу температурасына орнатылды. Бұл аймақтың сыртында температура қисығы табиғи түрде \(1/r\) (мұндағы \(r\) - радиалды координат) мәніне түседі.
а Дөңгелек аумақта тегіс температура профилін алу үшін алтын нанобөлшектерінің қабатын сәулелендіру үшін сақиналы лазер сәулесін пайдалану арқылы алынған CGM өлшемдерінің температуралық картасы. b Температура картасының изотермасы (а). Лазер сәулесінің контуры сұр нүктелі шеңбермен бейнеленген. Эксперимент екі рет қайталанды (Қосымша материалдарды, S4 суретін қараңыз).
Бактерия жасушаларының өміршеңдігі LA-HTM көмегімен бірнеше сағат бойы бақыланды. Суретте. 3 3 сағат 20 минуттық фильмнен түсірілген төрт кескіннің уақыт аралығын көрсетеді (M3 фильмі, қосымша ақпарат). Бактериялар лазермен анықталған дөңгелек аймақта белсенді түрде көбейетіні байқалды, мұнда температура оңтайлы, 65°C-қа жақындады. Керісінше, температура 10 секунд ішінде 50 ° C-тан төмен түскенде жасуша өсуі айтарлықтай төмендеді.
Әртүрлі уақытта лазермен қыздырғаннан кейін өсетін G. stearothermophilus бактерияларының оптикалық тереңдік суреттері, (а) t = 0 мин, (б) 1 сағ 10 мин, (в) 2 сағ 20 мин, (г) 3 сағ 20 мин. 200 Бір минуттық фильмнен алынған (Қосымша ақпаратта берілген M3 фильмі) сәйкес температуралық картаға салынған. Лазер \(t=0\) уақытында қосылады. Қарқындылық кескініне изотермалар қосылды.
Жасушалардың өсуін және оның температураға тәуелділігін одан әрі сандық анықтау үшін біз Movie M3 көру өрісінде бастапқы оқшауланған бактериялардың әртүрлі колонияларының биомассасының ұлғаюын өлшедік (4-сурет). Шағын колония түзетін бірлік (mCFU) түзілуінің басында таңдалған ата-аналық бактериялар S6 суретте көрсетілген. Құрғақ массаны өлшеу температураның таралуын картаға түсіру үшін пайдаланылған CGM 48 камерасымен алынды. CGM құрғақ салмақ пен температураны өлшеу қабілеті LA-HTM беріктігі болып табылады. Күтілгендей, жоғары температура бактериялардың тез өсуіне әкелді (4а-сурет). 4b-суреттегі жартылай журнал сызбасында көрсетілгендей, барлық температурадағы өсу экспоненциалды өсімнен кейін жүреді, мұнда деректер экспоненциалды функцияны пайдаланады \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), мұндағы \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – генерация уақыты (немесе екі еселену уақыты), \( g =1/ \tau\) – өсу қарқыны (уақыт бірлігіндегі бөлімдер саны ). Суретте. 4c температураның функциясы ретінде сәйкес өсу жылдамдығын және генерация уақытын көрсетеді. Жылдам өсетін mCFU екі сағаттан кейін өсудің қанығуымен сипатталады, жоғары бактериялық тығыздыққа байланысты күтілетін мінез-құлық (классикалық сұйық дақылдардағы стационарлық фазаға ұқсас). Жалпы пішін \(g\left(T\right)\) (4c-сурет) оңтайлы өсу қарқыны 60-65°C шамасында G. stearothermophilus үшін күтілетін екі фазалы қисыққа сәйкес келеді. Деректерді негізгі үлгіні пайдаланып сәйкестендіріңіз (S5-сурет)49 мұнда \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, бұл әдебиетте келтірілген басқа мәндермен жақсы сәйкес келеді49. Температураға тәуелді параметрлер қайталанатын болса да, \({G}_{0}\) максималды өсу жылдамдығы бір тәжірибеден екіншісіне өзгеруі мүмкін (S7-S9 суреттерін және M4 фильмін қараңыз). Әмбебап болуы керек температураны орнату параметрлерінен айырмашылығы, максималды өсу жылдамдығы байқалатын микромасштаб геометриясы шегінде ортаның қасиеттеріне (қоректік заттардың болуы, оттегі концентрациясы) байланысты.
әр түрлі температурада микробтардың көбеюі. mCFU: Миниатюралық колонияларды қалыптастыру қондырғылары. Температура градиентінде өсетін жалғыз бактерия туралы бейнеден алынған деректер (M3 фильмі). b (a) сияқты жартылай логарифмдік шкала. c Өсу жылдамдығы\(\tau\) және генерация уақыты\(g\) сызықтық регрессиядан (b) есептелген. Көлденең қате жолақтары: өсу кезінде mCFU көру өрісіне кеңейтілген температура диапазоны. Тік қателік жолақтары: сызықтық регрессия стандартты қатесі.
Қалыпты өсуден басқа, кейбір бактериялар кейде лазерлік қыздыру кезінде көрінетін болды, бұл флагелла бар бактериялар үшін күтілетін әрекет. Қосымша ақпараттағы M5 фильмі мұндай жүзу әрекеттерін көрсетеді. Бұл тәжірибеде 1d, e және S3 суреттерінде көрсетілгендей температура градиентін жасау үшін біркелкі лазерлік сәулелену қолданылды. 5-сурет M5 фильмінен таңдалған екі сурет тізбегін көрсетеді, ол бір бактерияның бағытталған қозғалысты көрсететінін көрсетеді, ал барлық басқа бактериялар қозғалыссыз қалады.
Екі уақыт шеңбері (a) және (b) нүктелі шеңберлермен белгіленген екі түрлі бактерияның жүзуін көрсетеді. Суреттер M5 фильмінен алынған (қосымша материал ретінде берілген).
G. stearothermophilus жағдайында бактериялардың белсенді қозғалысы (5-сурет) лазер сәулесі қосылғаннан кейін бірнеше секундтан кейін басталды. Бұл бақылау осы термофильді микроорганизмнің температураның жоғарылауына уақытша реакциясын атап көрсетеді, мұны Мора және т.б. 24. Бактериялардың қозғалғыштығы және тіпті термотаксис тақырыбын LA-HTM көмегімен қосымша зерттеуге болады.
Микробтық жүзуді физикалық қозғалыстың басқа түрлерімен шатастыруға болмайды, атап айтқанда (i) белгілі бір бағыты жоқ хаотикалық қозғалыс болып көрінетін броундық қозғалыс, (ii) конвекция 50 және термофорез 43, температура бойымен қозғалыстың тұрақты ауытқуынан тұрады. градиент.
G. stearothermophilus қорғаныс ретінде қоршаған ортаның қолайсыз жағдайларына ұшыраған кезде төзімділігі жоғары спораларды (спора түзу) шығару қабілетімен танымал. Қоршаған орта жағдайлары қайтадан қолайлы болған кезде споралар өніп, тірі жасушаларды қалыптастырады және қайта өседі. Бұл споралану/өну процесі жақсы белгілі болғанымен, ол нақты уақытта ешқашан байқалмаған. LA-HTM пайдалана отырып, біз мұнда G. stearothermophilus өну оқиғаларының бірінші бақылауын хабарлаймыз.
Суретте. 6а 13 спорадан тұратын CGM жинағын пайдалану арқылы алынған оптикалық тереңдіктің (ОТ) уақыт аралығының кескіндерін көрсетеді. Барлық жинау уақытында (15 сағ 6 мин, \(t=0\) – лазерлік қыздырудың басы), 13 спораның 4-і өніп шықты, кезекті уақыт нүктелерінде \(t=2\) сағ, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' және \(11\) h \(30\)'. Осы оқиғалардың тек біреуі 6-суретте көрсетілгенімен, қосымша материалдағы M6 фильмінде 4 өну оқиғасын байқауға болады. Бір қызығы, өну кездейсоқ болып көрінеді: қоршаған орта жағдайларының бірдей өзгеруіне қарамастан, барлық споралар бір уақытта өнбейді және өнбейді.
a 8 OT кескінінен (майға батыру, 60x, 1,25 NA объектісі) және (b) G. stearothermophilus агрегаттарының биомасса эволюциясынан тұратын уақыт аралығы. c (b) Өсу қарқынының сызықтылығын ерекшелеу үшін жартылай журнал шкаласында сызылған (үзік сызық).
Суретте. 6b,c деректер жинаудың барлық кезеңінде уақыт функциясы ретінде көру өрісіндегі жасуша популяцияларының биомассасын көрсетеді. Құрғақ массаның жылдам ыдырауы күріште \(t=5\)h кезінде байқалады. 6b, c, кейбір ұяшықтардың көру өрісінен шығуына байланысты. Осы төрт оқиғаның өсу қарқыны \(0,77\pm 0,1\) сағ-1. Бұл мән жасушалар қалыпты өсетін 3. 3 және 4-суретте көрсетілген өсу жылдамдығынан жоғары. Споралардан G. stearothermophilus өсу жылдамдығының жоғарылауының себебі түсініксіз, бірақ бұл өлшемдер LA-HTM қызығушылығын көрсетеді және жасуша өмірінің динамикасы туралы көбірек білу үшін бір жасуша деңгейінде (немесе жалғыз mCFU деңгейінде) жұмыс істейді. .
LA-HTM әмбебаптығын және оның жоғары температуралардағы өнімділігін одан әрі көрсету үшін біз 80°C51 оңтайлы өсу температурасы бар гипертермофильді ацидофильді археа Sulfolobus shibatae өсуін зерттедік. G. stearothermophilus-пен салыстырғанда, бұл архейлердің морфологиясы да өте ерекшеленеді, олар ұзартылған таяқшаларға (бацилла) емес, 1 мкм шарларға (кокктарға) ұқсайды.
7a суреті CGM көмегімен алынған S. shibatae mCFU ретті оптикалық тереңдік кескіндерінен тұрады (Қосымша материалдардағы M7 көркем фильмін қараңыз). Бұл mCFU 73°C шамасында, 80°C оңтайлы температурадан төмен, бірақ белсенді өсу үшін температура диапазонында өседі. Біз бірнеше сағаттан кейін mCFU архейдің микрожүзіміне ұқсайтын бірнеше бөліну оқиғаларын байқадық. Осы OT кескіндерінен mCFU биомассасы уақыт бойынша өлшенді және 7b-суретте ұсынылды. Бір қызығы, S. shibatae mCFUs G. stearothermophilus mCFUs кезінде байқалған экспоненциалды өсімнен гөрі сызықтық өсуді көрсетті. Жасушаның өсу қарқынының табиғаты туралы көптен бері пікірталас 52 болды: кейбір зерттеулерде микробтардың олардың мөлшеріне пропорционалды өсу қарқыны (экспоненциалды өсу), басқалары тұрақты қарқынды (сызықтық немесе билинарлық өсу) көрсетеді. Цур және т.б.53 түсіндіргендей, экспоненциалды және (би) сызықтық өсуді ажырату биомасса өлшемдерінде <6% дәлдікті талап етеді, бұл QPM әдістерінің көпшілігі үшін қолжетімсіз, тіпті интерферометрияны да қамтиды. Цур және т.б.53 түсіндіргендей, экспоненциалды және (би) сызықтық өсуді ажырату биомасса өлшемдерінде <6% дәлдікті талап етеді, бұл QPM әдістерінің көпшілігі үшін қолжетімсіз, тіпті интерферометрияны да қамтиды. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях биомасса, ол QPM үшін большинства методов үшін недостижимо, басқа да интерферометрия пайдалану. Zur және т.б.53 түсіндіргендей, экспоненциалды және (би) сызықтық өсуді ажырату биомасса өлшемдерінде <6% дәлдікті талап етеді, бұл QPM әдістерінің көпшілігі үшін, тіпті интерферометрияны пайдаланғанда да мүмкін емес.Zur және т.б. түсіндіргендей. 53, экспоненциалды және (би) сызықтық өсуді ажырату биомасса өлшемдерінде 6%-дан аз дәлдікті талап етеді, бұл QPM әдістерінің көпшілігі үшін, тіпті интерферометрия қолданылғанда да қолжетімсіз. CGM бұл дәлдікке биомасса өлшемдерінде sub-pg дәлдігімен қол жеткізеді36,48.
a 6 OT кескінінен (майға батыру, 60x, NA мақсаты 1.25) және (b) CGM көмегімен өлшенген микро-CFU биомассасының эволюциясынан тұратын уақыт аралығы. Қосымша ақпарат алу үшін M7 фильмін қараңыз.
S. shibatae мінсіз сызықты өсуі күтпеген болды және әлі хабарланбаған. Дегенмен, экспоненциалды өсу күтілуде, өйткені уақыт өте келе 2, 4, 8, 16 ... жасушалардың бірнеше бөлінуі болуы керек. Біз сызықтық өсу жасушалардың тығыздығы тым жоғары болған кезде жасушалардың өсуі баяулап, ақырында тыныштық күйіне жеткені сияқты, жасушалардың тығыз жиналуына байланысты жасушаның тежелуіне байланысты болуы мүмкін деп болжадық.
Біз келесі бес қызығушылықты өз кезегінде талқылау арқылы қорытындылаймыз: қыздыру көлемінің төмендеуі, жылу инерциясының төмендеуі, алтын нанобөлшектеріне қызығушылық, сандық фазалық микроскопияға қызығушылық және LA-HTM қолдануға болатын ықтимал температура диапазоны.
Резистивті қыздырумен салыстырғанда, HTM әзірлеу үшін қолданылатын лазерлік қыздыру біз осы зерттеуде суреттейтін бірнеше артықшылықтарды ұсынады. Атап айтқанда, микроскоптың көру аймағындағы сұйық ортада қыздыру көлемі бірнеше (10 мкм) 3 көлемде сақталады. Осылайша, тек бақыланатын микробтар белсенді, ал басқа бактериялар тыныш күйде және үлгіні одан әрі зерттеу үшін пайдаланылуы мүмкін – жаңа температураны тексеру қажет болған сайын үлгіні өзгертудің қажеті жоқ. Сонымен қатар, микро масштабты қыздыру температураның үлкен диапазонын тікелей зерттеуге мүмкіндік береді: 4c суреті 3 сағаттық фильмнен (М3 фильмі) алынды, ол әдетте бірнеше үлгіні дайындауды және зерттеуді қажет етеді – зерттелетін үлгілердің әрқайсысы үшін бір. y – тәжірибедегі күндер санын көрсететін температура. Қыздырылған көлемді азайту микроскоптың барлық айналасындағы оптикалық компоненттерін, әсіресе объективті линзаны бөлме температурасында сақтайды, бұл осы уақытқа дейін қауымдастықтың басты мәселесі болды. LA-HTM кез келген линзалармен, соның ішінде майға батырылатын линзалармен пайдалануға болады және көру аймағындағы экстремалды температураларда да бөлме температурасында қалады. Біз осы зерттеуде хабарлаған лазерлік қыздыру әдісінің негізгі шектеуі жабыспайтын немесе қалқып кетпейтін жасушалар көру аймағынан алыс болуы және зерттеу қиын болуы мүмкін. Бірнеше жүз микроннан асатын температураның жоғарылауына қол жеткізу үшін төмен ұлғайтқыш линзаларды пайдалану уақытша шешім болуы мүмкін. Бұл сақтық кеңістіктік ажыратымдылықтың төмендеуімен бірге жүреді, бірақ егер мақсат микроорганизмдердің қозғалысын зерттеу болса, жоғары кеңістіктік рұқсат қажет емес.
Жүйені жылытуға (және салқындатуға) арналған уақыт шкаласы \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) оның өлшеміне байланысты , заңға сәйкес \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), мұнда \ (L\ ) - жылу көзінің сипаттамалық өлшемі (біздің зерттеуіміздегі лазер сәулесінің диаметрі \(L\ шамамен 100\) мкм), \(D\) - қоршаған ортаның жылулық диффузиялық қасиеті (біздің орта корпус, шыны және су Диффузия жылдамдығы\(D\ шамамен 2\есе {10}^{-7}\) м2/с). температураның өзгеруін күтуге болады, бұл лезде температураның көтерілуін орнату тәжірибенің ұзақтығын қысқартып қана қоймайды, сонымен қатар температура әсерлерін кез келген динамикалық зерттеу үшін нақты уақытты \(t=0\) жасауға мүмкіндік береді.
Біздің ұсынылған әдіс кез келген жарық сіңіретін субстратқа қолданылады (мысалы, ITO жабыны бар коммерциялық үлгілер). Дегенмен, алтын нанобөлшектері инфрақызыл сәулелерде жоғары сіңіруді және көрінетін диапазонда төмен сіңіруді қамтамасыз ете алады, олардың соңғы сипаттамалары көрінетін диапазонда тиімді оптикалық бақылау үшін қызығушылық тудырады, әсіресе флуоресценцияны пайдалану кезінде. Сонымен қатар, алтын биоүйлесімді, химиялық инертті, оптикалық тығыздықты 530 нм-ден жақын инфрақызылға дейін реттеуге болады, үлгіні дайындау қарапайым және үнемді29.
Көлденең торлы толқындық микроскопия (CGM) тек микромасштабта температураны бейнелеуге ғана емес, сонымен қатар биомассаны бақылауға мүмкіндік береді, бұл оны LA-HTM-мен бірге (қажет болмаса) әсіресе пайдалы етеді. Соңғы онжылдықта температуралық микроскопияның басқа әдістері, әсіресе биобейнелеу саласында әзірленді және олардың көпшілігі температураға сезімтал флуоресцентті зондтарды қолдануды талап етеді54,55. Дегенмен, бұл әдістер сынға ұшырады және кейбір есептер флуоресценцияның температурадан басқа көптеген факторларға байланысты болуы мүмкін болғандықтан, жасушалардағы температураның шынайы емес өзгерістерін өлшейді. Сонымен қатар, флуоресцентті зондтардың көпшілігі жоғары температурада тұрақсыз. Сондықтан QPM және әсіресе CGM оптикалық микроскопияның көмегімен жоғары температурадағы тіршілікті зерттеуге арналған тамаша температуралық микроскопия әдісі болып табылады.
80°С оңтайлы өмір сүретін S.shibatae зерттеулері LA-HTM қарапайым термофилдерді ғана емес, гипертермофилдерді де зерттеу үшін қолдануға болатынын көрсетеді. Негізінде, LA-HTM көмегімен жетуге болатын температура диапазонында шек жоқ, тіпті 100 ° C-тан жоғары температураға атмосфералық қысымда қайнамай жетуге болады, бұл атмосферада гидротермиялық химияны қолдануда біздің 38 тобы көрсеткендей. қысым A. Дәл осылай 40 алтын нанобөлшектерін қыздыру үшін лазер қолданылады. Осылайша, LA-HTM стандартты жағдайларда (яғни қоршаған ортаның күйзелісі кезінде) стандартты жоғары ажыратымдылықтағы оптикалық микроскопиямен бұрын-соңды болмаған гипертермофилдерді бақылау үшін пайдалану мүмкіндігіне ие.
Барлық эксперименттер қолдан жасалған микроскопты, соның ішінде Köhler жарықтандыруын (LED, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), қолмен xy қозғалысы бар үлгі ұстағышты, мақсаттарды (Olympus, 60x, 0,7 NA, ауа, LUCPlanFLN60X немесе 60x, NA 1il) пайдалану арқылы орындалды. , UPLFLN60XOI), CGM камерасы (QLSI көлденең торы, 39 мкм қадам, Andor Zyla камера сенсорынан 0,87 мм) қарқындылық пен толқындық кескінді қамтамасыз етеді және sCMOS камерасы (ORCA Flash 4.0 V3, 16 биттік режим, Хамамацудан) 5-суретте көрсетілген деректер (бактериялық жүзу). Дихрикалық сәулені бөлгіш 749 нм BrightLine жиегі болып табылады (Semrock, FF749-SDi01). Камераның алдыңғы жағындағы сүзгі 694 қысқа өту сүзгісі (FF02-694/SP-25, Semrock). Титан сапфир лазері (Laser Verdi G10, 532 нм, 10 Вт, айдалатын цунами лазерінің қуысы, 2-5-суреттегі Spectra-physics, одан әрі Millenia лазерімен ауыстырылды, Spectraphysics 10 Вт, сорылатын Мира лазері, 2-сурет үшін когерентті, -5). 6 және 7) толқын ұзындығына орнатылған \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм, ол алтын нанобөлшектердің плазмонды-резонанс спектріне сәйкес келеді. Кеңістіктік жарық модуляторлары (1920 × 1152 пиксель) Meadowlark Optics компаниясынан сатып алынды.
Кросс торлы толқындық микроскопия (CGM) - қарапайым камераның сенсорынан бір миллиметр қашықтықта екі өлшемді дифракциялық торды (айқас тор деп те аталады) біріктіруге негізделген оптикалық микроскопия әдісі. Осы зерттеуде біз пайдаланған CGM-дің ең көп таралған мысалы төрт толқын ұзындығы көлденең ығысу интерферометрі (QLSI) деп аталады, мұнда көлденең тор Primot және т.б. енгізген және патенттеген қарқындылық/фазалық шахмат үлгісінен тұрады. 200034. Тік және көлденең торлы сызықтар сенсорда тор тәрізді көлеңкелер жасайды, олардың бұрмалануы түскен жарықтың оптикалық толқындық бұрмалануын (немесе баламалы фазалық профилін) алу үшін нақты уақытта сандық өңдеуге болады. Микроскопта пайдаланған кезде CGM камерасы нанометрлер реті бойынша сезімталдықпен оптикалық тереңдік (OT) деп те аталатын бейнеленген нысанның оптикалық жолының айырмашылығын көрсете алады36. Кез келген CGM өлшемінде, оптикалық құрамдас бөліктердегі немесе сәулелердегі кез келген ақауларды жою үшін бастапқы анықтамалық OT кескінін алып, кез келген кейінгі кескіндерден алып тастау керек.
Температуралық микроскопия анықтамада сипатталғандай CGM камерасы арқылы орындалды. 32. Қысқаша айтқанда, сұйықтықты қыздыру оның сыну көрсеткішін өзгертіп, түскен сәулені бұрмалайтын жылу линзасының әсерін тудырады. Бұл толқындық бет бұрмалануы CGM арқылы өлшенеді және сұйық ортада үш өлшемді температураның таралуын алу үшін деконволюция алгоритмі арқылы өңделеді. Егер алтын нанобөлшектері үлгі бойынша біркелкі таралса, жақсырақ кескіндер алу үшін бактерияларсыз аймақтарда температуралық картаны жасауға болады, бұл біз кейде жасаймыз. Анықтамалық CGM кескіні қыздырусыз (лазер өшірілген кезде) алынды және кейін лазер қосулы кезде кескіннің сол орнында түсірілді.
Құрғақ массаны өлшеуге температураны бейнелеу үшін пайдаланылатын бірдей CGM камерасы арқылы қол жеткізіледі. CGM анықтамалық кескіндері бактериялардың болуына байланысты ОТ-дағы кез келген біртексіздікті орташалау құралы ретінде экспозиция кезінде үлгіні x және y бойынша жылдам жылжыту арқылы алынды. Бактериялардың OT суреттерінен олардың биомассасы Matlab-тың қолдан жасалған сегменттеу алгоритмі ("Сандық код" тармақшасын қараңыз) арқылы таңдалған аумақтардағы кескіндер ансамблін пайдалану арқылы, сілтемеде сипатталған процедура бойынша алынды. 48. Қысқаша айтқанда, \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} қатынасын қолданамыз. } x{{\mbox{d}}}y\), мұндағы \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) оптикалық тереңдік кескіні, \(m\) құрғақ салмақ және \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) тұрақты мән. Біз \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) мкм3/пг таңдадық, бұл тірі жасушаларға тән тұрақты.
Диаметрі 25 мм және қалыңдығы 150 мкм алтын нанобөлшектермен қапталған жабын сырғымасы алтын нанобөлшектері жоғары қаратып AttofluorTM камерасына (Термофишер) орналастырылды. Geobacillus stearothermophilus эксперименттердің әрбір күнінің алдында LB ортасында (200 айн/мин, 60°C) түнде алдын ала культураланды. Оптикалық тығыздығы (OD) 0,3-тен 0,5-ке дейінгі G. stearothermophilus суспензиясының 5 мкл тамшысы алтын нанобөлшектері бар жабынға орналастырылды. Содан кейін диаметрі 18 мм, ортасында диаметрі 5 мм тесігі бар дөңгелек қақпақ сырғытпасы тамшыға түсіп, тесігінің ортасына бірдей оптикалық тығыздықтағы 5 мкл бактериалды суспензия қайта-қайта жағылды. Қаптамалардағы ұңғымалар н.с.-де сипатталған процедураға сәйкес дайындалды. 45 (қосымша ақпаратты Қосымша ақпаратты қараңыз). Содан кейін сұйық қабаттың кеуіп кетуіне жол бермеу үшін жабынға 1 мл LB ортасын қосыңыз. Инкубация кезінде ортаның булануын болдырмау үшін соңғы жапқыш Attofluor™ камерасының жабық қақпағының үстіне қойылады. Өндіру тәжірибелері үшін біз әдеттегі тәжірибелерден кейін кейде үстіңгі жапырақты жабатын спораларды қолдандық. Осыған ұқсас әдіс Sulfolobus shibatae алу үшін қолданылды. 182 (DSMZ) ортада Thiobacillus serrata алдын ала өсіру үш күн (200 айн/мин, 75°С) жүргізілді.
Алтын нанобөлшектерінің үлгілері мицеллярлы блокты сополимерлі литография әдісімен дайындалды. Бұл процесс тарауда егжей-тегжейлі сипатталған. 60. Қысқаша, алтын иондарын қаптайтын мицеллалар сополимерді толуолдағы HAuCl4-пен араластыру арқылы синтезделді. Содан кейін тазартылған жабындар ерітіндіге батырылды және алтын дәндерін алу үшін қалпына келтіру агентінің қатысуымен ультракүлгін сәулеленумен өңделеді. Ақырында, алтын тұқымдары KAuCl4 және этаноламиннің сулы ерітіндісімен қабықшаға 16 минут бойы тигізу арқылы өсірілді, бұл жақын инфрақызыл сәуледе сфералық емес алтын нанобөлшектерінің квазипериодты және өте біркелкі орналасуына әкелді.
Интерферограммаларды OT кескіндеріне түрлендіру үшін біз сілтемеде егжей-тегжейлі көрсетілгендей, үйде жасалған алгоритмді қолдандық. 33 және келесі жалпы репозиторийде Matlab бумасы ретінде қол жетімді: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакет жазылған интерферограммалар (анықтамалық кескіндерді қоса) және камера массивінің қашықтығы негізінде қарқындылық пен OT кескіндерін есептей алады.
Берілген температура профилін алу үшін SLM-ге қолданылған фазалық үлгіні есептеу үшін біз келесі жалпы репозиторийде қолжетімді бұрын әзірленген үй алгоритмін39,42 қолдандық: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Кіріс - сандық немесе монохромды bmp кескіні арқылы орнатуға болатын қажетті температура өрісі.
Ұяшықтарды сегменттеу және олардың құрғақ салмағын өлшеу үшін біз келесі жалпы репозиторийде жарияланған Matlab алгоритмін қолдандық: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Әрбір суретте пайдаланушы қызықтыратын бактерияны немесе mCFU түймесін басып, таяқшаның сезімталдығын реттеп, таңдауды растауы керек.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Табиғатты зерттеу есебінің аннотациясын қараңыз.
Осы зерттеудің нәтижелерін растайтын деректер негізделген сұрау бойынша тиісті авторлардан қол жетімді.
Осы зерттеуде пайдаланылған бастапқы код Әдістер бөлімінде егжей-тегжейлі берілген және жөндеу нұсқаларын https://github.com/baffou/ сайтынан келесі репозитарийлерден жүктеп алуға болады: SLM_temperatureShaping, CGMprocess және CGM_magicWandSegmentation.
Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. және Шарма, AK Термофилдер және олардың кең спектрлі қолданбалары туралы түсінік. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. және Шарма, AK Термофилдер және олардың кең спектрлі қолданбалары туралы түсінік.Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. және Шарма, А.К. Термофилдерге шолу және олардың кең қолданылуы. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. және Шарма, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамл Д. және Шарма А.К. Термофилдерді терең түсіну және қолданудың кең ауқымы.3 Биотехнология 6, 81 (2016).
Жіберу уақыты: 26 қыркүйек 2022 ж