Альцгеймер ауруында (АД) оның көптеген негізгі патофизиологиясын көрсететін ақуыз биомаркерлері жетіспейді, бұл диагностика мен емдеудің барысына кедергі келтіреді. Мұнда біз AD патофизиологиясының кең ауқымын көрсететін цереброспинальды сұйықтық (CSF) биомаркерлерін анықтау үшін жан-жақты протеомиканы қолданамыз. Мультиплекстік масс-спектрометрия AD CSF және мидағы шамамен 3500 және шамамен 12000 ақуызды анықтады. Ми протеомының желілік талдауы биоәртүрліліктің 44 модулін шешті, олардың 15-і ми-жұлын сұйықтығы протеомымен қабаттасады. Осы қабаттасатын модульдердегі CSF AD маркерлері әртүрлі патофизиологиялық процестерді білдіретін бес ақуыз тобына бүктелген. AD миындағы синапстар мен метаболиттер азаяды, бірақ CSF жоғарылайды, бұл кезде ми мен мидағы глиалға бай миелинизация және иммундық топтар жоғарылайды. Панель өзгерістерінің консистенциясы мен ауру ерекшелігі 500-ден астам қосымша CSF үлгілерінде расталды. Бұл топтар сонымен қатар симптомсыз АД-да биологиялық топшаларды анықтады. Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер AD клиникалық қолданбалары үшін веб-негізделген биомаркер құралдарының перспективалы қадамы болып табылады.
Альцгеймер ауруы (АД) бүкіл әлемде нейродегенеративті деменцияның ең көп тараған себебі болып табылады және синаптикалық беріліс, глиальды делдал иммунитет және митохондриялық метаболизмді қоса алғанда, биологиялық жүйе функцияларының кең ауқымымен сипатталады (1-3). Дегенмен, оның белгіленген ақуыз биомаркерлері әлі де амилоидты және тау ақуызын анықтауға бағытталған, сондықтан бұл әртүрлі патофизиологияны көрсете алмайды. Цереброспинальды сұйықтықта (CSF) ең сенімді түрде өлшенетін бұл «негізгі» ақуыз биомаркерлері мыналарды қамтиды: (i) амилоидты бета пептид 1-42 (Aβ1-42), бұл кортикальды амилоидты бляшкалардың түзілуін көрсетеді; (іі) толық тау, аксонның дегенерациясының белгісі; (iii) phospho-tau (p-tau), патологиялық тау гиперфосфорлануының өкілі (4-7). Цереброспинальды сұйықтықтың бұл биомаркерлері біздің «белгіленген» AD ақуыз ауруларын (4-7) анықтауды айтарлықтай жеңілдетсе де, олар аурудың артындағы күрделі биологияның кішкене бөлігін ғана білдіреді.
АД биомаркерлерінің патофизиологиялық әртүрлілігінің болмауы көптеген қиындықтарға әкелді, соның ішінде (i) АД пациенттерінің биологиялық гетерогенділігін анықтау және сандық анықтау қабілетсіздігі, (ii) аурудың ауырлығы мен прогрессиясының жеткіліксіз өлшеуі, әсіресе клиникаға дейінгі кезеңде, және ( iii) неврологиялық нашарлаудың барлық аспектілерін толығымен шеше алмаған емдік препараттарды әзірлеу. Қатысты аурулардан АД сипаттау үшін маңызды патологияға сүйенуіміз бұл проблемаларды тек одан сайын күшейтеді. Деменциясы бар егде жастағы адамдардың көпшілігінде когнитивті құлдыраудың бірнеше патологиялық белгілері бар екенін көбірек дәлелдемелер көрсетеді (8). АД патологиясы бар адамдардың 90% немесе одан да көпінде тамыр аурулары, TDP-43 қосындылары немесе басқа дегенеративті аурулар бар (9). Патологиялық қабаттасулардың жоғары пропорциялары біздің деменцияға арналған қазіргі диагностикалық жүйемізді бұзды және аурудың кеңірек патофизиологиялық анықтамасы қажет.
Әртүрлі АД биомаркерлерінің шұғыл қажеттілігін ескере отырып, өріс биомаркерлерді ашудың жалпы жүйесіне негізделген «омикс» әдісін көбірек қолдануда. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014 жылы іске қосылды және бағдарламаның алдыңғы қатарында. Ұлттық денсаулық сақтау институттарының, академиялық ортаның және өнеркәсіптің бұл көп салалы күш-жігері АД патофизиологиясын жақсырақ анықтау және биоәртүрлілікті диагностикалау және емдеу стратегияларын әзірлеу үшін жүйеге негізделген стратегияларды қолдануға бағытталған (10). Осы жобаның бір бөлігі ретінде желілік протеомика AD жүйесінде жүйелік биомаркерлерді жетілдірудің перспективалық құралы болды. Деректерге негізделген бұл бейтарап әдіс күрделі протеомика деректер жиынын белгілі бір жасуша түрлерімен, органеллалармен және биологиялық функциялармен байланыстырылған ақуыздардың топтарына немесе «модульдеріне» ұйымдастырады (11-13). AD миында 12 дерлік ақпаратқа бай желілік протеомика зерттеулері жүргізілді (13-23). Тұтастай алғанда, бұл талдаулар AD ми желісі протеомасының тәуелсіз когорттар мен көптеген кортикальды аймақтарда жоғары сақталған модульдік ұйымды қолдайтынын көрсетеді. Сонымен қатар, осы модульдердің кейбіреулері көптеген аурулардың патофизиологиясын көрсететін деректер жинақтары бойынша AD-мен байланысты молшылықтың қайталанатын өзгерістерін көрсетеді. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер AD жүйесінде жүйелік биомаркер ретінде ми желісі протеомын ашу үшін перспективалы тірек нүктесін көрсетеді.
AD ми желісі протеомын клиникалық пайдалы жүйеге негізделген биомаркерлерге айналдыру үшін біз мидан алынған желіні AD CSF протеомдық талдауымен біріктірдік. Бұл біріктірілген тәсіл миға негізделген патофизиологияның кең ауқымымен, соның ішінде синапстарды, қан тамырларын, миелинизацияны, қабынуды және метаболикалық жолдардың дисфункциясын қамтитын CSF биомаркерлерінің бес перспективалы жиынтығын анықтауға әкелді. Біз әртүрлі нейродегенеративті аурулардан алынған 500-ден астам CSF үлгілерін қоса, бірнеше репликация талдаулары арқылы осы биомаркер панельдерін сәтті растадық. Бұл валидациялық талдаулар асимптоматикалық АД (AsymAD) бар пациенттердің CSF-дегі топтық мақсаттарды зерттеуді немесе қалыпты когнитивтік ортада қалыптан тыс амилоид жинақталуының дәлелдерін көрсетуді қамтиды. Бұл талдаулар AsymAD популяциясының маңызды биологиялық гетерогенділігін көрсетеді және аурудың ең ерте кезеңдерінде тұлғаларды субтиптеуге қабілетті панельдік маркерлерді анықтайды. Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер AD тап болатын көптеген клиникалық қиындықтарды сәтті шеше алатын көптеген жүйелерге негізделген ақуыз биомаркері құралдарын әзірлеудегі негізгі қадам болып табылады.
Бұл зерттеудің негізгі мақсаты - АД-ға әкелетін әртүрлі миға негізделген патофизиологияны көрсететін жаңа цереброспинальды сұйықтық биомаркерлерін анықтау. S1 суретте біздің зерттеу әдістемеміз сипатталған, ол (i) миға қатысты бірнеше CSF ауруының биомаркерлерін анықтау үшін AD CSF және желілік ми протеомының алдын ала қорытындыларына негізделген кешенді талдауды және (ii) кейінгі репликацияны қамтиды. Бұл биомаркерлер бірнеше тәуелсіз цереброспинальды органдарда болады. сұйық когорттар. Жаңалыққа бағытталған зерттеу Эмори Гойзуета Альцгеймер ауруын зерттеу орталығында (ADRC) когнитивті қалыпты 20 адам мен 20 AD пациентіндегі CSF дифференциалды экспрессиясын талдаудан басталды. АД диагностикасы төменгі Aβ1-42 және ми-жұлын сұйықтығында жалпы tau және p-tau деңгейінің жоғарылауы болған кезде елеулі когнитивті бұзылу ретінде анықталады [Монреальдық когнитивтік бағалаудың орташа мәні (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ИФА) )]] (S1A кестесі). Бақылау (орташа MoCA, 26,7 ± 2,2) CSF биомаркерлерінің қалыпты деңгейіне ие болды.
Адамның CSF ақуыз молшылығының динамикалық диапазонымен сипатталады, онда альбумин және басқа да өте мол ақуыздар қызығушылық танытатын ақуыздарды анықтауға кедергі жасай алады (24). Ақуызды ашу тереңдігін арттыру үшін біз масс-спектрометрия (MS) талдауының алдында әрбір CSF үлгісінен алғашқы 14 жоғары мол ақуызды алып тастадық (24). MS арқылы барлығы 39 805 пептидтер анықталды, олар 40 үлгідегі 3691 протеомамен салыстырылды. Ақуыздың мөлшерін анықтау бірнеше тандемдік масс тегі (TMT) таңбалауымен орындалады (18, 25). Жетіспейтін деректерді шешу үшін біз кейінгі талдауға үлгілердің кемінде 50% сандық мөлшері анықталған белоктарды ғана қостық, осылайша 2875 протеоманың сандық мөлшерін анықтадық. Ақуыздың жалпы көптігі деңгейлеріндегі елеулі айырмашылыққа байланысты бақылау үлгісі статистикалық тұрғыдан шектен тыс көрсеткіш болып саналды (13) және кейінгі талдауға қосылмады. Қалған 39 үлгінің молшылық мәндері жасына, жынысына және партия ковариансына сәйкес түзетілді (13-15, 17, 18, 20, 26).
Регрессия деректер жинағындағы дифференциалды өрнекті бағалау үшін статистикалық t-тест талдауын пайдалана отырып, бұл талдау бақылау және AD жағдайлары арасында көптік деңгейлері айтарлықтай өзгерген (P <0,05) ақуыздарды анықтады (S2A кестесі). 1А-суретте көрсетілгендей, АД-да жалпы 225 ақуыздың көптігі айтарлықтай төмендеді, ал 303 ақуыздың көптігі айтарлықтай өсті. Бұл дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарға микротүтікшелермен байланысты ақуыз тау (MAPT; P = 3,52 × 10−8), нейрофиламент (NEFL; P = 6,56 × 10−3), өсумен байланысты протеин 43 сияқты бірнеше бұрын анықталған цереброспинальды сұйықтықтың AD маркерлері кіреді. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), май қышқылын байланыстыратын ақуыз 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), хитиназа 3 ұқсас 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), нейрондық гранулин (NRGN; P = 3,43 × 10−4) және VGF жүйке өсу факторы (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Дегенмен, біз сондай-ақ GDP диссоциациясының ингибиторы 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) және SPARC-қа қатысты модульдік кальцийді байланыстыру 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) сияқты басқа өте маңызды мақсаттарды анықтадық. Гендік онтология (GO) 225 айтарлықтай төмендеген ақуызды талдау стероид алмасуы, қанның коагуляциясы және гормондардың белсенділігі сияқты дене сұйықтығы процестерімен тығыз байланыстарды анықтады (1В-сурет және S2B кестесі). Керісінше, 303 ақуызының айтарлықтай жоғарылауы жасуша құрылымы мен энергия алмасуымен тығыз байланысты.
(A) Жанартау графигі бақылау (CT) мен арасындағы дифференциалды өрнекті анықтау үшін пайдаланылатын t-сынағы арқылы алынған -log10 статистикалық P мәніне (y-осі) қатысты log2 еселік өзгерісін (x осі) көрсетеді. Барлық белоктардың CSF протеомының AD жағдайлары. AD деңгейі айтарлықтай төмендеген белоктар (P <0,05) көк түспен, ал аурудағы деңгейі айтарлықтай жоғарылаған ақуыздар қызыл түспен көрсетілген. Таңдалған ақуыз таңбаланған. (B) Ақуызға қатысты жоғарғы GO терминдері AD-де айтарлықтай төмендейді (көк) және жоғарылайды (қызыл). Биологиялық процестер, молекулалық функциялар және жасушалық құрамдас бөліктер салаларында ең жоғары z ұпайлары бар үш GO терминін көрсетеді. (C) MS CSF үлгісіндегі MAPT деңгейін өлшеді (сол жақта) және оның ELISA tau үлгісімен корреляциясы (оң жақта). Тиісті P мәні бар Пирсон корреляция коэффициенті көрсетіледі. Бір AD жағдайы үшін ELISA деректерінің болмауына байланысты бұл сандар талданған 39 жағдайдың 38-інің мәндерін қамтиды. (D) Бақыланатын кластерлік талдау (P <0,0001, Бенджамин-Хочберг (BH) реттелетін P <0,01) бақылау және AD CSF деректер жинағындағы 65 ең маңызды өзгерген ақуызды пайдаланатын үлгілерді тапты. Стандарттау, нормалау.
MAPT протеомдық деңгейі тәуелсіз өлшенген ELISA tau деңгейімен тығыз байланысты (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1C сурет), біздің MS өлшеуіміздің жарамдылығын қолдайды. Амилоидты прекурсорлық ақуыз (APP) деңгейінде трипсинді қорытқаннан кейін, Aβ1-40 және Aβ1-42 C-терминусына сәйкес келетін изоформаға тән пептидтерді тиімді иондауға болмайды (27, 28). Сондықтан біз анықтаған APP пептидтерінің ELISA Aβ1-42 деңгейлеріне еш қатысы жоқ. Әрбір жағдайдың дифференциалды экспрессиясын бағалау үшін үлгілердің бақыланатын кластерлік талдауын орындау үшін P <0,0001 [жалған ашу жылдамдығы (FDR) түзетілген P <0,01] дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды қолдандық (S2A кестесі). 1D-суретте көрсетілгендей, бұл 65 аса маңызды белок бақылауға ұқсас сипаттамалары бар бір AD жағдайын қоспағанда, үлгілерді ауру күйіне сәйкес дұрыс топтастыруы мүмкін. Осы 65 ақуыздың 63-і AD-де өсті, ал тек екеуі (CD74 және ISLR) төмендеді. Жалпы алғанда, бұл цереброспинальды сұйықтық талдаулары аурудың биомаркерлері ретінде қызмет ете алатын AD-де жүздеген ақуыздарды анықтады.
Содан кейін біз AD ми протеомына тәуелсіз желілік талдау жасадық. Бұл ашылудың ми когорты бақылаудан алынған дорсотералды префронтальді кортексті (DLPFC) қамтиды (n = 10), Паркинсон ауруы (PD; n = 10), аралас AD/PD (n = 10) және AD (n = 10) жағдайлары. ) Үлгі. Эмери Гоизуэта ADRC. Осы 40 жағдайдың демографиясы бұрын сипатталған (25) және S1B кестесінде жинақталған. Біз осы 40 ми тінін және 27 жағдайдың репликация когортасын талдау үшін TMT-MS қолдандық. Жалпы алғанда, осы екі ми деректер жиынтығы 227 121 бірегей пептидтерді шығарды, олар 12 943 протеомға (25) сәйкес келеді. Кейінгі зерттеулерге кем дегенде 50% жағдайда саны анықталған ақуыздар ғана қосылды. Ақырғы ашылу деректер жинағында 8817 сандық ақуыз бар. Жасы, жынысы және өлгеннен кейінгі интервал (PMI) негізінде ақуыз көптігі деңгейін реттеңіз. Регрессиядан кейінгі деректер жиынтығының дифференциалды экспрессиялық талдауы екі немесе одан да көп ауру когорттарында >2000 ақуыз деңгейінің айтарлықтай өзгергенін көрсетті [P <0,05, дисперсияны талдау (ANOVA)]. Содан кейін біз дифференциалды түрде көрсетілген ақуыздарға және AD/бақылау және/немесе AD/PD салыстыруларында P <0,0001 (S2, A және B суреті, S2C кестесі) негізінде бақыланатын кластерлік талдау жасадық. Бұл 165 жоғары өзгертілген ақуыздар бақылау және ПД үлгілеріндегі AD патологиясы бар жағдайларды анық бейнелейді, бұл бүкіл протеомдағы күшті AD-спецификалық өзгерістерді растайды.
Содан кейін біз анықталған ми протеомында желілік талдауды орындау үшін Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) деп аталатын алгоритмді қолдандық, ол деректер жинағын ұқсас өрнек үлгілері бар ақуыз модульдеріне ұйымдастырады (11-13). Талдау ең үлкенінен (M1, n = 1821 белок) ең кішісіне (M44, n = 34 ақуыз) дейін сұрыпталған және нөмірленген 44 модульді (M) бірлесе экспрессияланған ақуыздарды анықтады (2А суреті және S2D кестесі) ). Жоғарыда айтылғандай (13) Әрбір модульдің репрезентативті экспрессиялық профилін немесе тән белокты есептеп, оны ауру күйімен және AD патологиясымен корреляциялаңыз, яғни Альцгеймер ауруы тізілімі (CERAD) мен Брак ұпайының альянсын құрыңыз (2В-сурет). Жалпы алғанда, 17 модуль AD невропатологиясына айтарлықтай қатысты болды (P <0,05). Бұл ауруға байланысты модульдердің көпшілігі жасуша түріне тән маркерлерге де бай (2В-сурет). Жоғарыда айтылғандай (13), жасуша түрін байыту модульдің қабаттасуын және жасуша типіне тән гендердің анықтамалық тізімін талдау арқылы анықталады. Бұл гендер оқшауланған тышқан нейрондарында, эндотелий және глиальды жасушаларда жарияланған деректерден алынған. РНҚ секвенирлеу (RNA-seq) тәжірибесі (29).
(A) Ми протеомының WGCNA-сын ашыңыз. (B) CERAD (Aβ тақтасы) және Браак (тау шатасу) ұпайларын қоса, AD невропатологиялық сипаттамалары (жоғарғы жағы) бар модульдік белгі ақуызының (модульдік ақуыз экспрессиясының бірінші негізгі компоненті) екі салмақты орта корреляциясы (BiCor) талдауы. Оң (қызыл) және теріс (көк) корреляцияның қарқындылығы екі түсті жылу картасымен көрсетіледі, ал жұлдызшалар статистикалық маңыздылықты көрсетеді (P <0,05). Әрбір ақуыз модулінің жасуша түрі байланысын бағалау үшін Гипергеометриялық Фишердің нақты сынағы (FET) (төменгі жағында) пайдаланыңыз. Қызыл реңктің қарқындылығы ұяшық түрінің байыту дәрежесін көрсетеді, ал жұлдызша статистикалық маңыздылықты көрсетеді (P <0,05). FET-тен алынған P мәнін түзету үшін BH әдісін пайдаланыңыз. (C) Модульдік белоктардың GO талдауы. Ең тығыз байланысты биологиялық процестер әрбір модуль немесе байланысты модуль тобы үшін көрсетілген. олиго, олигодендроцит.
Бес тығыз байланысты астроциттерге және микроглияға бай модульдер жиынтығы (M30, M29, M18, M24 және M5) AD невропатологиясымен күшті оң корреляцияны көрсетті (2В-сурет). Онтологиялық талдау бұл глиальды модульдерді жасушаның өсуімен, пролиферациясымен және иммунитетімен байланыстырады (2С-сурет және S2E кестесі). Екі қосымша глиальды модульдер, M8 және M22, ауру кезінде қатты реттеледі. M8 туа біткен иммундық жауапта шешуші рөл атқаратын сигналдық каскады болып табылатын Toll тәрізді рецепторлық жолымен тығыз байланысты (30). Сонымен қатар, M22 трансляциядан кейінгі модификациямен тығыз байланысты. Олигодендроциттерге бай M2 AD патологиясымен күшті оң корреляцияны және нуклеозидтер синтезімен және ДНҚ репликациясымен онтологиялық байланысты көрсетеді, бұл ауруларда жасушалардың пролиферациясының жоғарылауын көрсетеді. Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер біз бұрын AD желісі протеомында байқаған глиальды модульдердің жоғарылауын қолдайды (13, 17). Қазіргі уақытта желідегі AD-ге қатысты көптеген глиальды модульдер AD-де жоғарылаған ауру ерекшелігін көрсететін бақылау және PD жағдайларында өрнектің төменгі деңгейлерін көрсететіні анықталды (S2C сурет).
Біздің желілік протеомдағы тек төрт модуль (M1, M3, M10 және M32) AD патологиясымен қатты теріс корреляцияға ие (P <0,05) (2-сурет, В және С). M1 және M3 екеуі де нейрондық маркерлерге бай. M1 синаптикалық сигналдармен өте байланысты, ал M3 митохондриялық функциямен тығыз байланысты. M10 және M32 үшін ұяшық түрін байыту дәлелі жоқ. M32 M3 және жасуша метаболизмі арасындағы байланысты көрсетеді, ал M10 жасушаның өсуі мен микротүтіктердің функциясына жоғары байланысты. AD-мен салыстырғанда, барлық төрт модуль бақылауда және ПД-да ұлғайып, оларға ауруға тән AD өзгерістерін береді (S2C сурет). Жалпы алғанда, бұл нәтижелер біз бұрын AD-де байқаған нейронға бай модульдердің азаюын қолдайды (13, 17). Қорытындылай келе, біз ашқан ми протеомының желілік талдауы алдыңғы нәтижелерімізге сәйкес AD үшін арнайы өзгертілген модульдерді шығарды.
АД ерте асимптоматикалық кезеңмен (AsymAD) сипатталады, онда адамдар клиникалық когнитивті құлдыраусыз амилоидтардың жинақталуын көрсетеді (5, 31). Бұл асимптоматикалық кезең ерте анықтау және араласу үшін маңызды терезе болып табылады. Біз бұрын тәуелсіз деректер жинақтарында AsymAD және AD ми желісі протеомының күшті модульдік сақталуын көрсеттік (13, 17). Қазіргі уақытта біз ашқан ми желісі осы алдыңғы нәтижелерге сәйкес келетініне көз жеткізу үшін біз 27 DLPFC ұйымының репликацияланған деректер жинағындағы 44 модульдің сақталуын талдадық. Бұл ұйымдарға бақылау (n = 10), AsymAD (n = 8 ) және AD (n = 9) жағдайлары кіреді. Бақылау және AD үлгілері біздің ашылған ми когортының талдауына қосылды (кесте S1B), ал AsymAD жағдайлары тек репликация когортында бірегей болды. Бұл AsymAD жағдайлары Эмори Гоизуэта ADRC ми банкінен де келді. Өлім кезінде таным қалыпты болғанымен, амилоидтық деңгейлер әдеттен тыс жоғары болды (орташа CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B кестесі).
Осы 27 ми тінінің TMT-MS талдауы 11 244 протеоманың санын анықтауға әкелді. Бұл соңғы санға үлгілердің кемінде 50%-ында саны көрсетілген ақуыздар ғана кіреді. Бұл қайталанған деректер жинағында біздің ашқан ми талдауымызда анықталған 8817 ақуыздың 8638 (98,0%) бар және бақылау және AD когорттары арасында 3000-ға жуық айтарлықтай өзгерген белоктар бар (P <0,05, дисперсияны талдауға арналған Tukey жұптық t сынағынан кейін) ( S2F кестесі). Осы дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздардың ішінде 910 сонымен қатар AD және ми протеомын бақылау жағдайлары арасындағы маңызды деңгейдегі өзгерістерді көрсетті (P <0,05, ANOVA Tukey жұпталған t-сынағынан кейін). Айта кету керек, бұл 910 маркерлер протеомдар арасындағы өзгеру бағытында жоғары сәйкес келеді (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (S3A сурет). Көбейтілген белоктардың арасында деректер жинақтары арасында ең дәйекті өзгерістері бар белоктар негізінен глиалға бай M5 және M18 модульдерінің (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 және GFAP) мүшелері болып табылады. Азайған ақуыздардың ішінде ең тұрақты өзгерістері тек синапспен байланысты M1 модулінің (NPTX2, VGF және RPH3A) мүшелері болды. Біз ортаңғы буынның (MDK), CD44, бөлінетін бұйрамен байланысты ақуыз 1 (SFRP1) және VGF-тің AD-қа байланысты өзгерістерін вестерн блоттинг арқылы тексердік (S3B суреті). Модульді сақтау талдауы ми протеомындағы ақуыз модульдерінің шамамен 80%-ы (34/44) репликация деректер жинағында айтарлықтай сақталғанын көрсетті (z-score> 1,96, FDR түзетілген P <0,05) (S3C сурет). Осы модульдердің он төрті екі протеома арасында арнайы сақталған (z-score> 10, FDR түзетілген P <1,0 × 10−23). Тұтастай алғанда, дифференциалды экспрессиядағы және ми протеомы арасындағы модульдік құрамдағы жоғары дәрежелі консистенцияның ашылуы және репликациясы AD фронтальды қыртысының ақуыздарындағы өзгерістердің қайталану мүмкіндігін көрсетеді. Сонымен қатар, AsymAD және одан да дамыған аурулардың ми желісінің құрылымы өте ұқсас екенін растады.
Ми репликациясының деректер жинағындағы дифференциалды экспрессияның егжей-тегжейлі талдауы AsymAD протеинінің өзгерістерінің елеулі дәрежесін, соның ішінде AsymAD пен бақылау арасындағы жалпы 151 айтарлықтай өзгерген ақуызды көрсетеді (P <0,05) (S3D сурет). Амилоидтық жүктемеге сәйкес AsymAD және AD миындағы APP айтарлықтай өсті. MAPT тек AD кезінде айтарлықтай өзгереді, бұл шиеленістердің жоғарылау деңгейіне және оның когнитивті құлдыраумен белгілі корреляциясына сәйкес келеді (5, 7). Глиалға бай модульдер (M5 және M18) AsymAD-тағы ақуыздардың жоғарылауында жоғары дәрежеде көрінеді, ал нейронға қатысты M1 модулі AsymAD-дағы азайған ақуыздардың ең өкілі болып табылады. Осы AsymAD маркерлерінің көпшілігі симптоматикалық ауруларда үлкен өзгерістерді көрсетеді. Бұл маркерлердің арасында ми ісіктерімен және көздер мен аяқ-қолдардың дамуымен байланысты M18-ге жататын глиальды ақуыз SMOC1 бар (32). MDK – жасуша өсуіне және ангиогенезге қатысты гепаринді байланыстыратын өсу факторы (33), M18 басқа мүшесі. Бақылау тобымен салыстырғанда, AsymAD айтарлықтай өсті, содан кейін AD үлкен өсті. Керісінше, синаптикалық ақуыз нейропентраксин 2 (NPTX2) AsymAD миында айтарлықтай төмендеді. NPTX2 бұрын нейродегенерациямен байланысты болды және қоздырғыш синапстардың делдалында белгілі рөлі бар (34). Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер аурудың ауырлығына қарай ілгерілеуші сияқты көрінетін АД-дағы әртүрлі клиникаға дейінгі ақуыз өзгерістерін көрсетеді.
Мидың протеомын ашуда ақуызды қамтудың айтарлықтай тереңдігіне қол жеткізгенімізді ескере отырып, біз оның желілік деңгейдегі AD транскриптомымен сәйкестігін толық түсінуге тырысамыз. Сондықтан біз ашқан ми протеомын AD (n = 308) және бақылау (n = 157) DLPFC тіндеріндегі (13) 18 204 геннің микроарралық өлшеуінен бұрын жасаған модульмен салыстырдық. қабаттасу. Барлығы 20 түрлі РНҚ модулін анықтадық, олардың көпшілігі нейрондарды, олигодендроциттерді, астроциттерді және микроглияны қоса алғанда, нақты жасуша түрлерінің байытылуын көрсетті (3A сурет). Бұл модульдердің AD-дегі бірнеше өзгерістері 3В суретте көрсетілген. Тереңірек таңбаланбаған MS протеомын (шамамен 3000 белок) (13) қолданатын алдыңғы ақуыз-РНҚ қабаттасу талдауымызға сәйкес, біз тапқан ми протеомы желісіндегі 44 модульдің көпшілігі транскриптомдық желіде. Ешқандай маңызды қабаттасу жоқ. ми протеомында жоғары сақталған 34 ақуыз модулін ашу және репликациялау, тек 14 (~40%) Фишердің нақты сынағынан (FET) өтті, транскриптоммен статистикалық маңызды сәйкестік бар екенін дәлелдеді (3A сурет). ДНҚ зақымдануын қалпына келтірумен (P-M25 және P-M19), ақуызды трансляциялаумен (P-M7 және P-M20), РНҚ байланыстыру/сплайсингпен (P-M16 және P-M21) және ақуызды мақсаттылаумен (P-M13 және P-) үйлесімді. M23) транскриптомдағы модульдермен қабаттаспайды. Сондықтан, ағымдағы қабаттасу талдауында (13) тереңірек протеом деректер жинағы пайдаланылғанымен, AD желісі протеомының көпшілігі транскриптомдық желімен салыстырылмаған.
(A) Гипергеометриялық FET AD транскриптомының (жоғарғы) РНҚ модуліндегі жасуша түріне тән маркерлердің байытылуын және AD миының РНҚ (x осі) мен ақуыз (y осі) модульдерінің арасындағы қабаттасу дәрежесін көрсетеді. (төменгі). Қызыл реңктің қарқындылығы жоғарғы панельдегі ұяшық түрлерінің байыту дәрежесін және төменгі панельдегі модульдердің қабаттасуының қарқындылығын көрсетеді. Жұлдызшалар статистикалық маңыздылықты көрсетеді (P <0,05). (B) Әрбір транскриптомдық модульге тән гендер мен AD күйі арасындағы корреляция дәрежесі. Сол жақтағы модульдер AD-мен (көк) ең теріс корреляциялық, ал оң жақтағылар AD-мен (қызыл) ең оң корреляцияда. Лог-түрлендірілген BH-түзетілген P мәні әрбір корреляцияның статистикалық маңыздылық дәрежесін көрсетеді. (C) Ортақ ұяшық түрін байыту арқылы елеулі қабаттасатын модульдер. (D) қабаттасу модуліндегі таңбаланған ақуыздың (x-осі) және РНҚ-ның (y-осі) log2 есе өзгеруінің корреляциялық талдауы. Тиісті P мәні бар Пирсон корреляция коэффициенті көрсетіледі. Микро, микроглия; аспан денелері, астроциттер. КТ, бақылау.
Көптеген қабаттасатын ақуыз және РНҚ модульдері ұқсас жасуша түрін байыту профильдерін және тұрақты AD өзгерту бағыттарын бөліседі (3, В және С-сурет). Басқаша айтқанда, ми протеомының (PM1) синапспен байланысты M1 модулі AD-де орналасқан үш нейронға бай гомологиялық РНҚ модулімен (R-M1, R-M9 және R-M16) салыстырылады. төмендетілген деңгей. Сол сияқты глиалға бай M5 және M18 ақуыз модульдері астроциттер мен микроглиальды маркерлерге (R-M3, R-M7 және R-M10) бай РНҚ модульдерімен қабаттасады және аурулардың көбеюіне жоғары қатысады. Бұл екі деректер жиынтығы арасындағы ортақ модульдік мүмкіндіктер ми протеомында байқалған жасуша түрін байытуды және ауруға байланысты өзгерістерді одан әрі қолдайды. Дегенмен, біз осы ортақ модульдердегі жеке маркерлердің РНҚ мен ақуыз деңгейлері арасындағы көптеген елеулі айырмашылықтарды байқадық. Осы қабаттасатын модульдердегі молекулалардың протеомикасы мен транскриптомикасының дифференциалды экспрессиясының корреляциялық талдауы (3D-сурет) бұл сәйкессіздікті көрсетеді. Мысалы, APP және бірнеше басқа глиальды модуль ақуыздары (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 және SFRP1) AD протеомында айтарлықтай өсуді көрсетті, бірақ AD транскриптомында дерлік өзгеріс болған жоқ. Бұл ақуызға спецификалық өзгерістер амилоидты бляшкалармен тығыз байланысты болуы мүмкін (23, 35), патологиялық өзгерістердің көзі ретінде протеомды ерекшелейді және бұл өзгерістер транскриптомда көрсетілмеуі мүмкін.
Біз ашқан миды және CSF протеомдарын тәуелсіз талдағаннан кейін, біз ми желісінің патофизиологиясына қатысты AD CSF биомаркерлерін анықтау үшін екі деректер жиынтығына жан-жақты талдау жасадық. Біз алдымен екі протеоманың қабаттасуын анықтауымыз керек. CSF AD миындағы нейрохимиялық өзгерістерді көрсететіні кеңінен қабылданғанымен (4), AD миы мен CSF протеомы арасындағы сәйкестіктің нақты дәрежесі анық емес. Біздің екі протеомымызда анықталған ортақ ген өнімдерінің санын салыстыра отырып, біз ми-жұлын сұйықтығында анықталған ақуыздардың шамамен 70% (n = 1936) мида да сандық түрде анықталғанын анықтадық (4А-сурет). Осы қабаттасатын ақуыздардың көпшілігі (n = 1721) ашылған ми деректер жинағынан 44 бірлескен экспрессиялық модульдердің бірімен салыстырылады (4В-сурет). Күтілгендей, алты ең үлкен ми модулі (M1-ден M6) CSF қабаттасуының ең көп мөлшерін көрсетті. Дегенмен, кішірек ми модульдері (мысалы, M15 және M29) бар, олар күтпеген жерден қабаттасу дәрежесіне жетеді, ми модулінен екі есе үлкен. Бұл бізді ми мен жұлын сұйықтығы арасындағы сәйкестікті есептеу үшін егжей-тегжейлі, статистикалық негізделген әдісті қабылдауға итермелейді.
(A және B) Ашылған ми мен CSF деректер жинақтарында анықталған ақуыздар бір-біріне сәйкес келеді. Осы қабаттасатын ақуыздардың көпшілігі мидың бірлескен экспрессиялық желісінің 44 бірлескен экспрессиялық модульдерінің бірімен байланысты. (C) Цереброспинальды сұйықтық протеомы мен ми желісі протеомасының қабаттасуын ашыңыз. Жылу картасының әрбір жолы гипергеометриялық FET-тің бөлек қабаттасу талдауын білдіреді. Жоғарғы қатарда ми модулі мен бүкіл CSF протеомы арасындағы қабаттасу (сұр/қара көлеңке) бейнеленген. Екінші жол ми модульдері мен CSF протеині (қызыл түспен боялған) арасындағы қабаттасу AD-де айтарлықтай жоғары реттелетінін көрсетеді (P <0,05). Үшінші қатар ми модульдері мен CSF протеинінің (көк көлеңке) арасындағы қабаттасу AD-де айтарлықтай төмендетілгенін көрсетеді (P <0,05). FET-тен алынған P мәнін түзету үшін BH әдісін пайдаланыңыз. (D) Ұяшық түрінің байланысы мен қатысты GO шарттарына негізделген жиналмалы модуль тақтасы. Бұл панельдерде CSF протеомында мағыналы дифференциалды экспрессияға ие жалпы 271 миға қатысты ақуыздар бар.
Бір құйрықты FETs пайдалана отырып, біз CSF протеомы мен жеке ми модульдері арасындағы ақуыз қабаттасуының маңыздылығын бағаладық. Талдау нәтижесінде CSF деректер жинағындағы барлығы 14 ми модулінің статистикалық маңызды қабаттасулары (FDR түзетілген P <0,05) және қабаттасуы мәнділікке жақын (FDR түзетілген P = 0,06) қосымша модуль (M18) бар екені анықталды (4C суреті). , жоғарғы қатар). Біз сондай-ақ дифференциалды экспрессияланған CSF ақуыздарымен қатты қабаттасатын модульдерге қызығушылық танытамыз. Сондықтан, біз (i) CSF ақуызының қайсысының AD-де айтарлықтай жоғарылағанын және (ii) CSF ақуызының AD-де айтарлықтай төмендегенін анықтау үшін екі қосымша FET талдауын қолдандық (P <0,05, жұпталған t сынағы AD/бақылау) Маңызды қабаттасуы бар ми модульдері олардың арасында. 4C суретінің ортаңғы және төменгі жолдарында көрсетілгендей, бұл қосымша талдаулар 44 ми модулінің 8-і AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 және M38) қосылған ақуызмен айтарлықтай сәйкес келетінін көрсетеді. . ), ал тек екі модуль (M6 және M15) AD CSF-тегі төмендетілген протеинмен мағыналы қабаттасуды көрсетті. Күтілгендей, барлық 10 модуль CSF протеомымен ең жоғары қабаттасатын 15 модульде. Сондықтан, біз бұл 15 модуль AD миынан алынған CSF биомаркерлерінің жоғары өнімді көздері болып табылады деп есептейміз.
Біз осы 15 қабаттасатын модульдерді WGCNA ағаш диаграммасындағы жақындығына және олардың жасуша түрлерімен және ген онтологиясымен байланысына негізделген бес үлкен ақуыз панеліне бүктедік (4D-сурет). Бірінші панельде нейрондық маркерлерге және синапспен байланысты ақуыздарға (M1 және M12) бай модульдер кіреді. Синаптикалық панельде барлығы 94 ақуыз бар және CSF протеомындағы деңгейлер айтарлықтай өзгерді, бұл оны бес панельдің арасында миға қатысты CSF маркерлерінің ең үлкен көзі етеді. Екінші топ (M6 және M15) эндотелий жасушаларының маркерлерімен және тамыр денесімен тығыз байланысты көрсетті, мысалы, «жараның жазылуы» (M6) және «гуморальды иммундық жауапты реттеу» (M15). M15 сонымен қатар эндотелиймен тығыз байланысты липопротеидтер алмасуымен жоғары байланысты (36). Қан тамырлары панелінде миға қатысты 34 CSF маркерлері бар. Үшінші топқа олигодендроцит маркерлерімен және жасуша пролиферациясымен айтарлықтай байланысты модульдер (M2 және M4) кіреді. Мысалы, M2 жоғары деңгейдегі онтологиялық терминдеріне «ДНҚ репликациясының оң реттелуі» және «пурин биосинтезі процесі» жатады. Сонымен қатар, M4-ге «глиальды жасушалардың дифференциациясы» және «хромосомалардың бөлінуі» жатады. Миелинизация панелінде миға қатысты 49 CSF маркерлері бар.
Төртінші топта ең көп модульдер бар (M30, M29, M18, M24 және M5) және барлық дерлік модульдер микроглия мен астроцит маркерлеріне айтарлықтай бай. Миелинизация панеліне ұқсас, төртінші панельде жасуша пролиферациясымен тығыз байланысты модульдер (M30, M29 және M18) бар. Бұл топтағы басқа модульдер «иммундық әсер ету процесі» (M5) және «иммундық жауапты реттеу» (M24) сияқты иммунологиялық терминдермен өте байланысты. Глиальды иммундық топта миға қатысты 42 CSF маркерлері бар. Соңында, соңғы панель төрт модульдегі (M44, M3, M33 және M38) миға қатысты 52 маркерді қамтиды, олардың барлығы денеде энергияны сақтау және метаболизмге қатысты. Бұл модульдердің ең үлкені (M3) митохондриялармен тығыз байланысты және нейрондық спецификалық маркерлерге бай. M38 осы метаболоманың кішірек модуль мүшелерінің бірі болып табылады және сонымен қатар нейрондық спецификалықтың қалыптылығын көрсетеді.
Жалпы алғанда, бұл бес панель AD кортексіндегі жасуша түрлері мен функцияларының кең ауқымын көрсетеді және жиынтықта миға қатысты 271 CSF маркерлерін қамтиды (S2G кестесі). Осы MS нәтижелерінің дұрыстығын бағалау үшін біз мультиплекстеу мүмкіндіктері, жоғары сезімталдығы мен ерекшелігі бар ортогональды антиденелер негізіндегі технологияны жақындықты ұзарту талдауын (PEA) қолдандық және осы 271 биомаркердің ішкі жиынтығын тапқан цереброспинальды сұйықтық үлгілерін қайта талдадық. (n = 36). Бұл 36 мақсат біздің MS негізіндегі нәтижелерімізбен тығыз байланысты PEA AD еселігінің өзгеруін көрсетеді (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), бұл біздің жан-жақты MS талдауымыздың нәтижелерін қатты тексерді (S4 суреті). ).
Синаптикалық сигналдан энергетикалық метаболизмге дейін біздің бес топ атап көрсеткен биологиялық тақырыптардың барлығы АД патогенезімен байланысты (1-3). Сондықтан, осы панельдерді қамтитын барлық 15 модуль біз ашқан ми протеомындағы AD патологиясымен байланысты (2В-сурет). Ең маңыздысы - глиальды модульдер арасындағы жоғары оң патологиялық корреляция және ең үлкен нейрондық модульдер (M1 және M3) арасындағы күшті теріс патологиялық корреляция. Біздің репликацияланған ми протеомының дифференциалды экспрессиялық талдауы (S3D суреті) сонымен қатар M5 және M18-ден алынған глиальды ақуыздарды ерекшелейді. AsymAD және симптоматикалық АД-да глиальды ақуыздар мен M1-байланысты синапстар жоғарылайды. Ақуыз ең азаяды. Бұл бақылаулар бес топта біз анықтаған 271 цереброспинальды сұйықтық маркерлері AD кортексіндегі ауру процестеріне, соның ішінде ерте асимптоматикалық кезеңдерде болатын процестерге қатысты екенін көрсетеді.
Мидағы және жұлын сұйықтығындағы панель белоктарының өзгеру бағытын жақсырақ талдау үшін біз 15 қабаттасатын модульдердің әрқайсысы үшін келесіні сыздық: (i) ми деректер жинағындағы модуль көптігі деңгейін және (ii) модуль белок Айырмашылық жұлын сұйықтығында көрсетілген (S5 сурет). Жоғарыда айтылғандай, WGCNA мидағы модульдің көптігін немесе тән ақуыз мәнін анықтау үшін қолданылады (13). Вулкан картасы цереброспинальды сұйықтықтағы модульдік ақуыздардың дифференциалды экспрессиясын сипаттау үшін қолданылады (AD/бақылау). Бұл сандар бес панельдің үшеуі ми мен жұлын сұйықтығындағы әртүрлі экспрессиялық үрдістерді көрсететінін көрсетеді. Синапс панелінің екі модулі (M1 және M12) AD миындағы молшылық деңгейінің төмендеуін көрсетеді, бірақ AD CSF-тегі жоғарылаған ақуызмен айтарлықтай сәйкес келеді (S5A сурет). Метаболомы бар нейронға қатысты модульдер (M3 және M38) ми мен жұлын сұйықтығының ұқсас экспрессия үлгілерінің сәйкес келмейтінін көрсетті (S5E сурет). Тамырлы панель сонымен қатар әртүрлі экспрессиялық үрдістерді көрсетті, дегенмен оның модульдері (M6 және M15) AD миында қалыпты түрде жоғарылады және ауру CSF-де төмендеді (S5B сурет). Қалған екі панельде белоктары екі бөлімде де тұрақты түрде жоғары реттелетін үлкен глиальды желілер бар (S5, C және D суреті).
Бұл трендтер осы панельдердегі барлық маркерлерге ортақ емес екенін ескеріңіз. Мысалы, синаптикалық панель AD миында және CSF-де айтарлықтай азайған бірнеше ақуызды қамтиды (S5A сурет). Осы төмен реттелетін цереброспинальды сұйықтық маркерлерінің арасында NPTX2 және M1 VGF және M12 хромогранин В бар. Алайда, осы ерекшеліктерге қарамастан, біздің синаптикалық маркерлердің көпшілігі AD жұлын сұйықтығында жоғарылайды. Тұтастай алғанда, бұл талдаулар бес панельдің әрқайсысында ми мен жұлын сұйықтығы деңгейіндегі статистикалық маңызды үрдістерді ажырата алды. Бұл тенденциялар AD-де ми мен CSF протеинінің экспрессиясы арасындағы күрделі және жиі әртүрлі қарым-қатынасты көрсетеді.
Содан кейін біз биомаркерлердің 271 жинағын ең перспективалы және қайталанатын мақсаттарға дейін тарылту үшін жоғары өнімді MS репликация талдауын (CSF репликациясы 1) қолдандық (5А-сурет). CSF 1 көшірмесінде Emory Goizueta ADRC, соның ішінде бақылау, AsymAD және AD когорты (S1A кестесі) барлығы 96 үлгі бар. Бұл АД жағдайлары жеңіл когнитивтік құлдыраумен (орташа MoCA, 20,0 ± 3,8) және ми-жұлын сұйықтығында расталған AD биомаркерлеріндегі өзгерістермен сипатталады (S1A кестесі). Біз тапқан CSF талдауына қарамастан, бұл репликация тиімдірек және жоғары өнімді «бір реттік» MS әдісін (офф-лайн фракциясыз), соның ішінде жеке үлгілердің иммундық тапшылығын жою қажеттілігін болдырмайтын үлгіні дайындаудың оңайлатылған хаттамасын қолдану арқылы орындалады. . Оның орнына, азырақ белоктар сигналын күшейту үшін иммунитетті төмендететін жалғыз «күшейту арнасы» пайдаланылады (37). Бұл жалпы протеомды қамтуды азайтса да, бұл бір реттік әдіс машина уақытын айтарлықтай қысқартады және өміршеңдігін талдауға болатын TMT таңбаланған үлгілердің санын арттырады (17, 38). Жалпы алғанда, талдау 96 жағдайда 1183 протеомға сәйкес келетін 6 487 пептидті анықтады. Біз тапқан CSF талдауы сияқты, үлгілердің кем дегенде 50% санында көрсетілген ақуыздар ғана кейінгі есептеулерге қосылды және деректер жас пен жыныстың әсерлері үшін регрессияға ұшырады. Бұл 792 протеоманың түпкілікті санын анықтауға әкелді, олардың 95% табылған CSF деректер жинағында да анықталды.
(A) Бірінші репликацияланған CSF когортында тексерілген және соңғы панельге енгізілген миға қатысты CSF ақуызының мақсаттары (n = 60). (В-Е) Төрт CSF репликация когортында өлшенген панельдік биомаркер деңгейлері (композиттік z-баллдары). Әрбір қайталанатын талдаудағы молшылық өзгерістерінің статистикалық маңыздылығын бағалау үшін жұпталған t-тесттері немесе Tukey түзетуі бар ANOVA пайдаланылды. КТ, бақылау.
Біз жан-жақты талдау арқылы миға қатысты 271 CSF нысанасын тексеруге ерекше қызығушылық танытқандықтан, біз осы репликацияланған протеомды әрі қарай зерттеуді осы маркерлермен шектейміз. Осы 271 ақуыздың ішінде 100-і CSF репликациясында анықталды. Синапстық және метаболиттік гистондар АД-де ең жоғары өседі, ал тамырлық белоктар ауру кезінде азаяды. 100 қабаттасатын маркерлердің көпшілігі (n = 70) екі деректер жиынындағы өзгерістің бірдей бағытын сақтады (S6B суреті). Бұл 70 расталған миға қатысты CSF маркерлері (S2H кестесі) негізінен бұрын байқалған панельді экспрессия тенденцияларын көрсетеді, яғни тамыр ақуыздарының төмендеуін және барлық басқа панельдердің жоғары реттелуін көрсетеді. Осы 70 расталған протеиннің тек 10-ы осы панельдік трендтерге қайшы келетін AD көптігіндегі өзгерістерді көрсетті. Ми мен жұлын сұйықтығының жалпы тенденциясын жақсы көрсететін панель жасау үшін біз осы 10 ақуызды біз ақырында тексерген қызығушылық панелінен шығардық (5А-сурет). Сондықтан, біздің панель, сайып келгенде, әртүрлі үлгілерді дайындау және MS платформасын талдау арқылы екі тәуелсіз CSF AD когорттарында тексерілген жалпы саны 60 ақуызды қамтиды. CSF көшірме 1 бақылауындағы және AD жағдайларындағы осы соңғы панельдердің z-балы өрнек сызбалары біз тапқан CSF когортында байқалған панель трендін растады (5В-сурет).
Осы 60 ақуыздың ішінде көптеген зерттеулерде AD-мен байланысқан қабынуға қарсы цитокин болып табылатын остеопонтин (SPP1) және GAP43, синаптикалық ақуыз сияқты АД-мен байланысы бар молекулалар бар. бұл нейродегенерациямен анық байланысты (42). Ең толық тексерілген ақуыздар амиотрофиялық бүйірлік склерозға (ALS) байланысты супероксид дисмутаза 1 (SOD1) және Паркинсон ауруымен байланысты десахараза (PARK7) сияқты басқа нейродегенеративті ауруларға қатысты маркерлер болып табылады. Біз сондай-ақ SMOC1 және миға бай мембраналық тіркеме сигнал беретін ақуыз 1 (BASP1) сияқты көптеген басқа маркерлердің нейродегенерацияға бұрынғы байланыстары шектеулі екенін тексердік. Айта кету керек, олардың CSF протеомындағы жалпы саны аз болғандықтан, MAPT және басқа да AD-қа қатысты ақуыздарды (мысалы, NEFL және NRGN) сенімді анықтау үшін бір реттік анықтау әдісін пайдалану қиын. ) ( 43, 44).
Содан кейін біз осы 60 басымдықты панель маркерлерін үш қосымша қайталанатын талдауда тексердік. CSF Copy 2-де біз Emory Goizueta ADRC (17) 297 бақылау және AD үлгілерінен тұратын тәуелсіз когортты талдау үшін жалғыз TMT-MS қолдандық. CSF репликациясы 3 Лозаннадан, Швейцариядан (45) 120 бақылау және AD пациенттерінен қол жетімді TMT-MS деректерін қайта талдауды қамтиды. Біз әрбір деректер жинағындағы 60 басымдық маркердің үштен екісінен астамын анықтадық. Швейцариялық зерттеу әртүрлі MS платформалары мен TMT сандық әдістерін пайдаланғанымен (45, 46), біз екі қайталанатын талдауда (5-сурет, C және D және S2, I және J кестелері) панельдік трендтерді қатты қайталадық. Біздің топтың аурудың ерекшелігін бағалау үшін біз TMT-MS төртінші репликация деректер жинағын (CSF репликациясы 4) талдау үшін қолдандық, оған бақылау (n = 18) және AD (n = 17) жағдайлары ғана емес, сонымен қатар PD (n = 17) кіреді. n = 14)), ALS (n = 18) және фронто-уақытша деменция (FTD) үлгілері (n = 11) (S1A кестесі). Біз осы когорттағы панель белоктарының үштен екісіне жуығын сәтті анықтадық (60-тың 38-і). Бұл нәтижелер барлық бес биомаркер панеліндегі AD-ға тән өзгерістерді көрсетеді (5E суреті және S2K кестесі). Метаболиттер тобының ұлғаюы ең күшті AD ерекшелігін көрсетті, одан кейін миелинизация және глиальды топ. Аз дәрежеде FTD осы панельдер арасындағы өсуді көрсетеді, бұл ұқсас ықтимал желі өзгерістерін көрсетуі мүмкін (17). Керісінше, ALS және PD бақылау тобымен бірдей дерлік миелинизация, глиальды және метаболом профильдерін көрсетті. Тұтастай алғанда, үлгіні дайындаудағы, MS платформасындағы және TMT сандық анықтау әдістеріндегі айырмашылықтарға қарамастан, бұл қайталанатын талдаулар біздің басымдықты панель маркерлерінің 500-ден астам бірегей CSF үлгілерінде жоғары дәйекті AD-спецификалық өзгерістері бар екенін көрсетеді.
АД нейродегенерациясы когнитивтік белгілердің басталуынан бірнеше жыл бұрын кеңінен танылды, сондықтан AsymAD биомаркерлеріне шұғыл қажеттілік бар (5, 31). Дегенмен, көбірек дәлелдер AsymAD биологиясы біртекті емес екенін көрсетеді және тәуекел мен тұрақтылықтың күрделі өзара әрекеттесуі аурудың кейінгі прогрессінде үлкен жеке айырмашылықтарға әкеледі (47). AsymAD жағдайларын анықтау үшін пайдаланылғанымен, негізгі CSF биомаркерлерінің деңгейлері (Aβ1-42, жалпы тау және p-tau) кімнің деменцияға көшетінін сенімді түрде болжай алмайтыны дәлелденген жоқ (4, 7), бұл көбірек болуы мүмкін осы популяцияның тәуекелін дәл стратификациялау үшін ми физиологиясының көптеген аспектілеріне негізделген тұтас биомаркер құралдарын қосу қажет. Сондықтан, біз кейіннен CSF 1 көшірмесінің AsymAD популяциясында AD расталған биомаркер панелін талдадық. Бұл 31 AsymAD жағдайы қалыпты емес негізгі биомаркер деңгейлерін (Aβ1–42/жалпы tau ELISA қатынасы, <5,5) және толық танымды (орташа MoCA, 27,1) көрсетті. ± 2.2) (S1A кестесі). Сонымен қатар, AsymAD бар барлық адамдарда 0-ге тең клиникалық деменция баллы бар, бұл күнделікті когнитивті немесе функционалдық көрсеткіштердің төмендеуінің дәлелі жоқ екенін көрсетеді.
Біз алдымен AsymAD когортын қоса алғанда, барлық 96 CSF көшірмелері 1-де расталған панельдердің деңгейлерін талдадық. Біз AsymAD тобындағы бірнеше панельдерде AD-ге ұқсас молшылықтың елеулі өзгерістері бар екенін анықтадық, тамырлы панель AsymAD-та төмендеу тенденциясын көрсетті, ал қалған барлық панельдер жоғарылау тенденциясын көрсетті (6А-сурет). Сондықтан барлық панельдер ELISA Aβ1-42 және жалпы tau деңгейлерімен өте маңызды корреляцияны көрсетті (6В-сурет). Керісінше, топ пен MoCA ұпайы арасындағы корреляция салыстырмалы түрде нашар. Осы талдаулардың ең таңқаларлық нәтижелерінің бірі - AsymAD когортындағы панельдердің көптігі. 6А-суретте көрсетілгендей, AsymAD тобының панельдік деңгейі әдетте басқару тобының және AD тобының панельдік деңгейін кесіп өтеді, бұл салыстырмалы түрде жоғары өзгергіштік көрсетеді. AsymAD осы гетерогенділігін одан әрі зерттеу үшін біз 96 CSF репликациясының 1 жағдайына көпөлшемді масштабтау (MDS) талдауын қолдандық. MDS талдауы деректер жиынындағы белгілі бір айнымалылар негізінде жағдайлар арасындағы ұқсастықты визуализациялауға мүмкіндік береді. Бұл кластерлік талдау үшін біз тек CSF табу және репликация 1 протеомы (n = 29) (S2L кестесі) деңгейінде статистикалық маңызды өзгерісі (P <0,05, AD/бақылау) бар тексерілген панель маркерлерін ғана пайдаланамыз. Бұл талдау біздің бақылауымыз бен AD жағдайлары арасында айқын кеңістіктік кластерлерді жасады (6С-сурет). Керісінше, кейбір AsymAD жағдайлары бақылау тобында анық кластерленген, ал басқалары AD жағдайларында орналасқан. Осы AsymAD гетерогендігін одан әрі зерттеу үшін біз MDS картасын осы AsymAD жағдайларының екі тобын анықтау үшін пайдаландық. Бірінші топқа бақылауға жақынырақ кластерленген AsymAD жағдайлары кірді (n = 19), ал екінші топқа AD-ге жақын маркер профилі бар AsymAD жағдайлары сипатталды (n = 12).
(A) AsymAD қоса алғанда, CSF репликациясының 1 когортындағы барлық 96 үлгідегі CSF биомаркер тобының өрнек деңгейі (z-балл). Тукейдің кейінгі түзетуімен дисперсияны талдау панельдердің көптігі өзгерістерінің статистикалық маңыздылығын бағалау үшін пайдаланылды. (B) ELISA Aβ1-42 және CSF көшірме 1 үлгілеріндегі MoCA баллымен және жалпы tau деңгейімен панельдік ақуыз көптігі деңгейінің (z-баллының) корреляциялық талдауы. Тиісті P мәні бар Пирсон корреляция коэффициенті көрсетіледі. (C) 96 CSF көшірме 1 жағдайының MDS табылған және CSF көшірме 1 деректер жиынында айтарлықтай өзгертілген 29 расталған панель маркерлерінің молшылық деңгейлеріне негізделген [P <0,05 AD/control (CT)]. Бұл талдау AsymAD тобын бақылау (n = 19) және AD (n = 12) топшаларына бөлу үшін пайдаланылды. (D) Жанартау сызбасы AsymAD екі топшасының арасындағы -log10 статистикалық P мәніне қатысты log2 есе өзгеруі (x осі) бар барлық CSF репликациясының 1 белоктарының дифференциалды көрінісін көрсетеді. Панельдің биомаркерлері түсті. (E) CSF репликациясы 1 іріктеу тобының биомаркерлерінің молшылық деңгейі AsymAD кіші топтары арасында дифференциалды түрде көрсетіледі. Тукейдің кейінгі түзетілген дисперсия талдауы статистикалық маңыздылықты бағалау үшін пайдаланылды.
Біз осы бақылау мен AD тәрізді AsymAD жағдайлары арасындағы дифференциалды ақуыз экспрессиясын зерттедік (6D суреті және S2L кестесі). Алынған жанартау картасы екі топ арасында 14 панельдік маркердің айтарлықтай өзгергенін көрсетеді. Бұл маркерлердің көпшілігі синапс пен метаболоманың мүшелері болып табылады. Дегенмен, сәйкесінше миелин және глиальды иммундық топтардың мүшелері болып табылатын SOD1 және миристилденген аланинге бай протеинкиназа С субстраты (MARCKS) да осы топқа жатады (6-сурет, D және E). Тамырлы панель сонымен қатар AD тәрізді AsymAD тобында айтарлықтай төмендеген екі маркерді, соның ішінде AE байланыстыратын ақуыз 1 (AEBP1) және комплемент отбасы мүшесі C9 қосады. ELISA AB1-42 (P = 0,38) және p-tau (P = 0,28) бойынша бақылау және AD тәрізді AsymAD ішкі топтары арасында айтарлықтай айырмашылық болмады, бірақ жалпы tau деңгейінде (P = 0,0031) айтарлықтай айырмашылық болды. ) (S7-сурет). Екі AsymAD ішкі топтары арасындағы өзгерістердің жалпы тау деңгейлерінен (мысалы, YWHAZ, SOD1 және MDH1) маңыздырақ екенін көрсететін бірнеше панель маркерлері бар (6E сурет). Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер біздің расталған панельде асимптоматикалық ауруы бар науқастардың ықтимал қауіп стратификациясын және қосалқы түрін көрсете алатын биомаркерлер болуы мүмкін екенін көрсетеді.
AD артындағы әртүрлі патофизиологияны жақсырақ өлшеу және мақсатты бағыттау үшін жүйеге негізделген биомаркер құралдарының шұғыл қажеттілігі бар. Бұл құралдар біздің AD диагностикалық жүйемізді өзгертіп қана қоймайды, сонымен қатар тиімді, пациентке арнайы емдеу стратегияларын қабылдауға ықпал етеді (1, 2). Осы мақсатта біз миға негізделген патофизиологияның кең ауқымын көрсететін веб-негізделген CSF биомаркерлерін анықтау үшін AD миына және CSF-ге бейтарап кешенді протеомика әдісін қолдандық. Біздің талдауымыз бес CSF биомаркер панелін шығарды, олар (i) синапстарды, қан тамырларын, миелинді, иммундық және метаболикалық дисфункцияны көрсетеді; (ii) әртүрлі MS платформаларында күшті қайталану мүмкіндігін көрсету; (iii) AD ерте және кеш кезеңдерінде прогрессивті ауруға тән өзгерістерді көрсетіңіз. Тұтастай алғанда, бұл нәтижелер AD зерттеулері мен клиникалық қолданбаларға арналған әртүрлі, сенімді, веб-бағдарланған биомаркер құралдарын әзірлеуге бағытталған перспективалы қадам болып табылады.
Біздің нәтижелеріміз AD ми желісі протеомының жоғары деңгейде сақталған ұйымын көрсетеді және оны жүйеге негізделген биомаркерді дамыту үшін якорь ретінде пайдалануды қолдайды. Біздің талдауымыз көрсеткендей, AD және AsymAD милары бар екі тәуелсіз TMT-MS деректер жиынтығы күшті модульдікке ие. Бұл тұжырымдар алдыңғы жұмысымызды кеңейтеді, бұл фронтальды, париетальды және уақытша кортекстегі көптеген тәуелсіз когорттардан 2000-нан астам ми тіндерінің қуатты модульдерінің сақталуын көрсетеді (17). Бұл консенсус желісі қазіргі зерттеулерде байқалған ауруға байланысты әртүрлі өзгерістерді көрсетеді, соның ішінде глиалға бай қабыну модульдерінің ұлғаюы және нейронға бай модульдердің азаюы. Ағымдағы зерттеулер сияқты, бұл кең ауқымды желі AsymAD-да әртүрлі клиникаға дейінгі патофизиологияларды көрсететін маңызды модульдік өзгерістерді ұсынады (17).
Дегенмен, бұл өте консервативті жүйеге негізделген құрылымда, әсіресе AD-ның бастапқы кезеңдеріндегі адамдар арасында, ұсақ түйіршікті биологиялық гетерогенділік бар. Біздің биомаркер панелі бірнеше CSF маркерлерінің маңызды дифференциалды көрінісін көрсететін AsymAD-те екі топшаны бейнелей алады. Біздің топ AD биомаркерлерінің негізгі деңгейінде айқын болмаған осы екі кіші топ арасындағы биологиялық айырмашылықтарды көрсете алды. Бақылау тобымен салыстырғанда, осы AsymAD тұлғаларының Aβ1-42/жалпы tau қатынасы әдеттен тыс төмен болды. Дегенмен, тек жалпы tau деңгейлері екі AsymAD кіші топтары арасында айтарлықтай ерекшеленді, ал Aβ1-42 және p-tau деңгейлері салыстырмалы түрде салыстырмалы болып қалды. Жоғары CSF tau Aβ1-42 деңгейлеріне қарағанда (7) когнитивті симптомдардың жақсы болжаушысы болып көрінетіндіктен, екі AsymAD когортасында аурудың өршу қаупі әртүрлі болуы мүмкін деп күдіктенеміз. Біздің AsymAD таңдау көлемінің шектеулі екенін және бойлық деректердің жоқтығын ескере отырып, осы қорытындыларды сенімді түрде жасау үшін қосымша зерттеулер қажет. Дегенмен, бұл нәтижелер жүйеге негізделген CSF панелі аурудың асимптоматикалық сатысында адамдарды тиімді стратификациялау қабілетімізді арттыра алатынын көрсетеді.
Тұтастай алғанда, біздің нәтижелеріміз АД патогенезіндегі көптеген биологиялық функциялардың рөлін қолдайды. Дегенмен, реттелмеген энергия алмасуы біздің барлық расталған бес таңбалау тақтасының басты тақырыбы болды. Гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) және лактатдегидрогеназа А (LDHA) сияқты метаболикалық ақуыздар AD CSF жоғарылауы жоғары репродуктивті жыныс екенін көрсететін ең сенімді расталған синаптикалық биомаркерлер болып табылады. Біздің қан тамырларымыз бен глиальды панельдерімізде тотығу заттарының алмасуына қатысатын бірнеше маркерлер де бар. Бұл тұжырымдар нейрондардың жоғары энергия сұранысын қанағаттандыру үшін ғана емес, сонымен қатар астроциттердің және басқа глиальды жасушалардың жоғары энергия сұранысын қанағаттандыру үшін метаболикалық процестердің бүкіл мида атқаратын негізгі рөліне сәйкес келеді (17, 48). Біздің нәтижелеріміз тотығу-тотықсыздану потенциалындағы өзгерістер мен энергетикалық жолдардың үзілуі митохондриялық бұзылыстарды, глиалды қабынуды және тамырлы зақымдануды қоса алғанда, AD патогенезіне қатысатын бірнеше негізгі процестер арасындағы негізгі байланыс болуы мүмкін екендігі туралы өсіп келе жатқан дәлелдерді қолдайды (49). Сонымен қатар, метаболикалық цереброспинальды сұйықтық биомаркерлерінде біздің бақылауымыз бен AD тәрізді AsymAD топшалары арасында дифференциалды түрде бай ақуыздардың көп саны бар, бұл осы энергетикалық және тотығу-тотықсыздану жолдарының бұзылуы аурудың клиникаға дейінгі кезеңінде маңызды болуы мүмкін екенін болжайды.
Біз байқаған ми мен жұлын сұйықтығы панелінің әртүрлі тенденциялары да қызықты биологиялық әсерлерге ие. Нейрондарға бай синапстар мен метаболомдар AD миындағы деңгейлердің төмендеуін және цереброспинальды сұйықтықтың көптігін көрсетеді. Нейрондар өздерінің көптеген арнайы сигналдарын энергиямен қамтамасыз ету үшін синапстарда энергия өндіретін митохондрияларға бай екенін ескере отырып (50), осы екі нейрондық топтың экспрессиялық профильдерінің ұқсастығы күтіледі. Нейрондардың жоғалуы және зақымдалған жасушалардың экструзиясы кейінгі аурудың осы ми мен CSF панелінің тенденцияларын түсіндіре алады, бірақ олар біз байқаған панельдік өзгерістерді түсіндіре алмайды (13). Ерте асимптоматикалық аурудағы бұл тұжырымдардың бір ықтимал түсіндірмесі қалыпты емес синаптикалық кесу болып табылады. Тінтуір үлгілеріндегі жаңа дәлелдер микроглия арқылы жүретін синаптикалық фагоцитоздың AD-де қалыпты емес белсендірілуі және мидағы ерте синапстың жоғалуына әкелуі мүмкін екенін көрсетеді (51). Бұл тасталған синаптикалық материал CSF-да жиналуы мүмкін, сондықтан нейрондық панельде CSF ұлғаюын байқаймыз. Иммундық синаптикалық кесу сонымен қатар аурудың бүкіл кезеңінде ми мен жұлын сұйықтығында байқайтын глиальды ақуыздардың көбеюін ішінара түсіндіре алады. Синаптикалық кесуден басқа, экзоцитарлы жолдағы жалпы ауытқулар нейрондық маркерлердің әртүрлі ми мен CSF өрнектеріне әкелуі мүмкін. Бірқатар зерттеулер АД миының патогенезінде экзосомалардың мазмұны өзгергенін көрсетті (52). Жасушадан тыс жол Aβ пролиферациясына да қатысады (53, 54). Айта кету керек, экзосомалық секрецияның басылуы AD трансгенді тінтуір үлгілерінде AD тәрізді патологияны төмендетуі мүмкін (55).
Сонымен қатар, тамырлы панельдегі ақуыз АД миының қалыпты өсуін көрсетті, бірақ CSF айтарлықтай төмендеді. Гематоэнцефалдық бөгет (BBB) дисфункциясы бұл нәтижелерді ішінара түсіндіре алады. Көптеген тәуелсіз өлімнен кейінгі адам зерттеулері AD кезінде BBB ыдырауын көрсетті (56, 57). Бұл зерттеулер эндотелий жасушаларының тығыз жабылған қабатының айналасындағы әртүрлі ауытқуларды растады, соның ішінде ми капиллярларының ағуы және қан арқылы берілетін ақуыздардың периваскулярлық жинақталуы (57). Бұл мидағы қан тамырларының белоктарының жоғарылауына қарапайым түсініктеме бере алады, бірақ бұл сол ақуыздардың цереброспинальды сұйықтықтағы сарқылуын толық түсіндіре алмайды. Мүмкіндіктердің бірі - орталық жүйке жүйесі қабыну мен тотығу стрессінің жоғарылауы мәселесін шешу үшін осы молекулаларды белсенді түрде оқшаулайды. Осы панельдегі кейбір ең ауыр CSF ақуыздарының азаюы, әсіресе липопротеиндерді реттеуге қатысатындар, қабынудың зиянды деңгейлерін және реактивті оттегі түрлерінің нейропротекторлық процесін тежеумен байланысты. Бұл қан айналымындағы тотығу стресс деңгейін төмендетуге жауапты липопротеинді байланыстыратын фермент болып табылатын пароксоназа 1 (PON1) үшін дұрыс (58, 59). Альфа-1-микроглобулин/бикунин прекурсоры (AMBP) тамырлар тобының басқа айтарлықтай төмендетілген маркері болып табылады. Ол липидті тасымалдаушы бикуниннің прекурсоры болып табылады, ол қабынуды басуға және неврологиялық қорғанысқа да қатысады (60, 61).
Әртүрлі қызықты гипотезаларға қарамастан, биохимиялық аурулардың механизмдерін тікелей анықтау мүмкін еместігі ашуға негізделген протеомика талдауының белгілі шектеуі болып табылады. Сондықтан, осы биомаркер панельдерінің артындағы механизмдерді сенімді түрде анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет. MS негізіндегі клиникалық талдауды дамытуға көшу үшін болашақ бағыт сонымен қатар іріктелген немесе параллель реакция мониторингі сияқты ауқымды биомаркерді тексерудің мақсатты сандық әдістерін қолдануды талап етеді (62). Жақында біз осы жерде сипатталған CSF протеинінің көптеген өзгерістерін тексеру үшін параллель реакция мониторингін (63) қолдандық. Бірнеше басымдықты панель мақсаттары айтарлықтай дәлдікпен сандық түрде анықталады, соның ішінде YWHAZ, ALDOA және SMOC1, олар тиісінше синапс, метаболизм және қабыну панельдеріне сәйкес келеді (63). Тәуелсіз деректерді жинау (DIA) және басқа MS негізіндегі стратегиялар мақсатты тексеру үшін де пайдалы болуы мүмкін. Bud және т.б. (64) Жақында біздің CSF ашу деректер жинағында анықталған AD биомаркерлері мен үш түрлі еуропалық когортадан алынған 200-ге жуық CSF үлгілерінен тұратын тәуелсіз DIA-MS деректер жинағы арасында айтарлықтай сәйкестік бар екені көрсетілді. Бұл соңғы зерттеулер біздің панельдеріміздің сенімді MS негізіндегі анықтауға айналу әлеуетін қолдайды. Дәстүрлі антиденелер мен аптамер негізіндегі анықтау AD негізгі биомаркерлерін одан әрі дамыту үшін де маңызды. CSF аз мөлшерде болғандықтан, жоғары өнімділікті MS әдістерін қолдана отырып, бұл биомаркерлерді анықтау қиынырақ. NEFL және NRGN - бұл біздің жан-жақты талдауымызда панельде көрсетілген, бірақ біздің жалғыз MS стратегиямызды пайдалану арқылы сенімді түрде анықтау мүмкін емес, аз мөлшердегі CSF биомаркерлерінің екі мысалы. PEA сияқты бірнеше антиденелерге негізделген мақсатты стратегиялар осы маркерлердің клиникалық түрленуіне ықпал етуі мүмкін.
Жалпы, бұл зерттеу әртүрлі жүйелерге негізделген CSF AD биомаркерлерін анықтау және тексеру үшін бірегей протеомика әдісін ұсынады. Қосымша AD когорттары мен MS платформаларында осы маркер панельдерін оңтайландыру AD қаупін стратификациялау мен емдеуді ілгерілетуге мүмкіндік береді. Уақыт өте келе бұл панельдердің бойлық деңгейін бағалайтын зерттеулер де маркерлердің қай комбинациясы аурудың ерте даму қаупін және аурудың ауырлық дәрежесінің өзгеруін жақсырақ стратификациялайтынын анықтау үшін өте маңызды.
CSF арқылы көшірілген 3 үлгіні қоспағанда, осы зерттеуде пайдаланылған барлық CSF үлгілері Emory ADRC немесе жақын байланысты зерттеу мекемелерінің қамқорлығымен жиналды. Осы протеомика зерттеулерінде Emory CSF үлгілерінің жалпы төрт жиынтығы пайдаланылды. CSF когортында 20 сау бақылау және 20 AD пациенттерінің үлгілері бар екені анықталды. CSF 1 көшірмесі 32 сау бақылау, 31 AsymAD және 33 AD жеке тұлғаларының үлгілерін қамтиды. CSF 2 көшірмесі 147 басқару элементін және 150 AD үлгісін қамтиды. Көп ауру CSF репликациясының 4 когорты 18 бақылауды, 17 AD, 19 ALS, 13 PD және 11 FTD үлгілерін қамтиды. Эмори университетінің институттық шолу кеңесі бекіткен келісімге сәйкес, Эмори зерттеуінің барлық қатысушылары ақпараттандырылған келісім алды. Альцгеймер орталықтарына арналған 2014 жылғы Қартаюдың ең жақсы тәжірибелері бойынша Ұлттық институттың нұсқауларына сәйкес (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), ми-жұлын сұйықтығы белдік пункция арқылы жиналып, сақталды. Бақылау және AsymAD және AD пациенттері Emory когнитивтік неврология клиникасында немесе Goizueta ADRC-те стандартталған когнитивті бағалау алды. Олардың цереброспинальды сұйықтық үлгілері INNO-BIA AlzBio3 Luminex арқылы ELISA Aβ1-42, жалпы tau және p-tau талдаулары үшін сыналған (65 ). ELISA мәндері белгіленген AD биомаркерінің шекті критерийлеріне негізделген субъектілердің диагностикалық жіктелуін қолдау үшін пайдаланылады (66, 67). Басқа CSF диагноздарына (FTD, ALS және PD) арналған негізгі демографиялық және диагностикалық деректер де Emory ADRC немесе еншілес зерттеу мекемелерінен алынған. Осы Emory CSF жағдайлары үшін жиынтық іс метадеректерін S1A кестесінде табуға болады. Швейцариялық CSF репликациясының 3 когортасының сипаттамалары бұрын жарияланған (45).
CSF үлгіні тапты. CSF деректер жинағын ашудың тереңдігін арттыру үшін трипсинациядан бұрын жоғары протеиндердің иммундық тұтынуы орындалды. Қысқаша айтқанда, 40 жеке CSF үлгілерінен 130 мкл CSF және тең көлемде (130 мкл) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) айналдыру бағанына (Thermo Fisher Scientific, A89868 бөлмесінде) орналастырылды. температура Инкубация). 15 минут айналдырғаннан кейін үлгіні 1000 г 2 минут бойы центрифугалаңыз. 3K ультрацентрифугалық сүзгі құрылғысы (Millipore, UFC500396) 30 минут бойы 14,000 г центрифугалау арқылы ағынды үлгіні концентраттау үшін пайдаланылды. Барлық үлгі көлемін фосфатты буферлі физиологиялық ерітіндімен 75 мкл дейін сұйылтыңыз. Ақуыз концентрациясы өндірушінің (Thermo Fisher Scientific) хаттамасына сәйкес бицинхонин қышқылы (BCA) әдісімен бағаланды. Барлық 40 үлгідегі иммундық тапшылығы бар CSF (60 мкл) лизил эндопептидазамен (LysC) және трипсинмен қорытылды. Қысқаша айтқанда, үлгі 10 минут бойы 90°C температурада 1,2 мкл 0,5 М трис-2(-карбоксиэтил)-фосфин және 3 мкл 0,8 М хлорацетамидпен азайтылды және алкилирленді, содан кейін су моншасында 15 минут бойы ультрадыбыстық әсерге ұшырады. Үлгі 193 мкл 8 М мочевина буферімен [8 М мочевина және 100 мМ NaHPO4 (рН 8,5)] 6 М мочевинаның соңғы концентрациясына дейін сұйылтылған. LysC (4,5 мкг; Вако) бөлме температурасында түнде ас қорыту үшін қолданылады. Содан кейін үлгі 50 мМ аммоний бикарбонаты (ABC) бар 1 М мочевинаға дейін сұйылтылды (68). Бірдей мөлшерде (4,5 мкг) трипсин (Promega) қосыңыз, содан кейін үлгіні 12 сағат бойы инкубациялаңыз. Қорытылған пептид ерітіндісін 1% құмырсқа қышқылы (FA) және 0,1% трифторсірке қышқылы (TFA) (66) соңғы концентрациясына дейін қышқылдандырыңыз, содан кейін жоғарыда сипатталғандай 50 мг Sep-Pak C18 бағанымен (Сулар) тұзсыздандырыңыз (25) . Содан кейін пептид 1 мл 50% ацетонитрилде (ACN) элюцияланды. Топтамалар (25) бойынша ақуыз мөлшерін стандарттау үшін аралас үлгіні жасау үшін барлық 40 CSF үлгілерінен 100 мкл аликвоттар біріктірілді, содан кейін ол бес жаһандық ішкі стандартты (GIS) (48) үлгіге бөлінді. Барлық жеке үлгілер мен аралас стандарттар жоғары жылдамдықтағы вакууммен (Labconco) кептіріледі.
CSF үлгіні көшіреді. Дайон мен оның әріптестері 3 үлгідегі CSF көшірмесінің иммундық әлсіреуі мен қорытылуын бұрын сипаттаған болатын (45, 46). Қалған қайталанатын үлгілер жеке иммундық тапшылыққа ұшыраған жоқ. Осы алынбаған үлгілерді бұрын сипатталғандай трипсинде қорытыңыз (17). Әрбір қайталанатын талдау үшін әрбір үлгідегі элютті пептидтің 120 мкл аликвоты біріктіріліп, TMT таңбаланған жаһандық ішкі стандарт ретінде пайдалану үшін бірдей көлемдегі аликвоттарға бөлінді (48). Барлық жеке үлгілер мен аралас стандарттар жоғары жылдамдықтағы вакууммен (Labconco) кептіріледі. Төмен мөлшердегі CSF протеинінің сигналын күшейту үшін әрбір үлгіден 125 мкл біріктіру арқылы әрбір қайталанатын талдау үшін «жақсартылған» үлгі дайындалды [яғни, зерттеу үлгісіне ұқсайтын биологиялық үлгі, бірақ қол жетімді сома әлдеқайда үлкен (37, 69)] аралас CSF үлгісіне біріктірілді (17). Содан кейін аралас үлгі жоғарыда сипатталғандай қорытылып, 12 мл High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) арқылы иммундық жойылды және кейінгі бірнеше TMT таңбалауына қосылды.
Жіберу уақыты: 27 тамыз 2021 ж